链脲佐菌素致大鼠糖尿病模型的实验研究

               作者：张静 吴靖芳 郑慧娥 张 耕 王志勇 王浩宇 任君旭 
【摘要】  目的:探讨链脲佐菌素诱导速发型SD大鼠实验性糖尿病模型的建立。方法：采用一次性向大鼠腹腔内注射链脲佐菌素的方法,实验中监测血糖，并取胰腺组织用组织化学和免疫组织化学染色,以Motic Med 60显微图像分析系统分析糖尿病大鼠胰岛细胞的数量改变。结果：注射48h后大鼠血糖明显升高，并出现糖尿病表现。形态学观察到胰岛萎缩，B细胞数量明显减少(P＜001)，灰度降低。结论：一次性足量给予SD大鼠链脲佐菌素，可成功复制出速发型糖尿病动物模型，此药物导致糖尿病的机制是损伤B细胞。此建模方法简单，费用低，血糖反应敏感，为糖尿病组织病理研究及相关实验提供了一个较好模型。

    【关键词】  糖尿病；动物模型；链脲佐菌素；大鼠

    【ABSTRACT】  Objective：To investigate the establishment of rapid diabetic experimental models in SD rats with streptozotocin(STZ). Methods：The rapid diabetic model of SD rats was duplicated with STZ once intraperitoneally.The changes of blood sugar was measured during the experiment.The tissue sections of pancreas were stained by HE and immunohistochemistry.With Motic Med 60 analyse the change of pancreas. Results：48 hours after injection,blood sugar exceeded evidently and diabetic symptoms appeared gradually in the ratsMorphological investigation on pancreas showed the reduction of islets,loss of B cells and decrease of grey value after injection of STZ. Conclusion：This study shows that the STZinduced rapid diabetic experimental models is a successful model and B cells damage is the mechanism of diabetes in rats induced by STZ. Establishment of rapid diabetic experimental models with STZ provides an easily accessible and inexpensive way and with the methods the reaction of blood sugar is sensible.It also provides a better model for histopathological study and experiment in diabetes.

    【KEY WORDS】  Diabetes；Animal model；Streptozotocin；Rat

    目前我国糖尿病的发病率呈升高趋势，但发病机理尚未完全阐明，在预防和方面仍不完善，建立理想的动物模型对进一步研究糖尿病具有重要的意义。链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）原是作为一种抗生素开发的，1963年，Rakieten等报道该药还有促进糖尿病的作用[1]。现利用链脲佐菌素诱导的糖尿病模型已广泛应用于糖尿病研究的各个领域。本实验通过一次足量向大鼠腹腔注射链脲佐菌素，使大鼠患糖尿病，建立糖尿病模型，通过对胰岛组织的结构变化来探讨此模型建立的可行性,并探讨链脲佐菌素可能的致病机理。

    1  材料与方法

    11  实验动物:SD大鼠共30只,近交系,体重200～250g,雌雄不限,水和标准食物块自由摄取,由军事医学院动物实验中心提供。大鼠分为正常对照组(CON)、糖尿病1周组(DM1w)、糖尿病1月组(DM1)、3月组(DM3)和6月组(DM6),每组各6只。

    12  试剂:链脲佐菌素(Sigma公司)，临用前以无菌枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液配制pH=42、浓度为25mg/ml的工作液。

    13  仪器:美国Ames公司Glucometer3微量血糖测定仪和血糖试纸检测、Motic Med 60医学图像分析系统。

    14  模型制作：健康SD大鼠禁食10h，按50mg/kg剂量向大鼠腹腔内注入25mg/ml浓度的STZ,注药后48h测血糖，血糖连续2次超过168mmol/L并稳定5d者选为糖尿病模型。同时分别于建模成功后1周、1、3、6个月处死大鼠，分离胰腺，用10%bouins液固定，逐级脱水，石蜡包埋，切片，苏木精―伊红（HE）染色,mallaroy染色,鼠胰岛素单克隆抗体免疫组织化学ABC染色。

    2  结果

    21  外貌：糖尿病鼠建模成功后，1周内出现多饮、多尿症状，随着病程的进展,1月内有多尿、多食、搔痒,毛失去光泽等症出现，3月时脱毛、消瘦明显、活动减少,有些大鼠在病程6个月后出现尿量减少，死亡。

    22  血糖：CON组及DM各组大鼠在注射STZ前尿糖为阴性,注射48ｈ后，CON组大鼠的血糖值为(42±04)mmol/L,而DM各组在注射STZ后48ｈ血糖值85%超过168mmol/L,平均为(237±48)mmol/Ｌ,以后血糖值持续在这一水平。10%在128～16mmol/L之间，一般不会形成糖尿病。1%大鼠偶有死亡。可见ＤＭ组大鼠的血糖值明显高于CON组及注射STZ前（Ｐ＜001）,见图7。图1，3，5  分别为糖尿病大鼠胰岛HE染色、醛复红染色和Ins免疫组化染色。

　23  形态学观察  低倍镜下，HE染色可见：周围结缔组织和基膜不完整，胰岛体积减小，形态极不规则。高倍镜下，可见细胞容积减低，胞浆变浅，胞核固缩或呈残影，似乎代表萎缩消失前状态（图1，2）。醛复红染色发现胰岛B细胞形态变小，稀疏，着色浅紫红色，细胞数量和灰度值明显低于正常组（图3，4）。高倍镜下可见胰岛细胞发生退行性改变,表现为胰岛细胞肿胀、胞质着色浅、空泡增多、细胞核固缩、染色质分布不均、边集、有的细胞核缺失、只残留伊红浅染的细胞质,上述改变随病程的延长而逐渐加重,到病程6月时变化更加严重。

    24  INS免疫组化  用特异性胰岛素抗体(insulin,INS)对各组胰岛行免疫组织化学染色后。正常组INS阳性细胞（B细胞）占胰岛细胞的75%左右，DM1w、DM1、DM3和DM6各组胰岛INS阳性细胞明显减少（图5，6）。与正常对照组相比面密度和灰度及细胞百分比均减少（P＜001）。

    3  讨论

　复制实验性糖尿病动物模型的方法比较多，如手术切除胰腺、药物注射（STZ、四氧嘧啶）等，但目前常用注射链脲佐菌素制备糖尿病动物模型。链脲佐菌素（STZ）为一种广谱抗菌素,具有抗菌、抗肿瘤的性能和致糖尿病的副作用,对实验动物的胰岛B细胞具有高度选择性的毒性作用[1]。STZ诱导的糖尿病因给药方式、剂量不同,其成模效果也有所差别。1985年赵凌云等使用一次性腹腔注射50mg/kg STZ建立了速发型大鼠糖尿病模型[2]；沈亚非等[3]通过实验表明腹腔注射与尾静脉注射两种途径在诱导实验性糖尿病动物模型无显著差异，所以我们选取50mg/kg的STZ单剂腹腔内注射，对SD大鼠进行实验。从实验结果看，STZ注射后动物血糖升高，并伴有多饮、多食、多尿、消瘦症状；从胰岛病理改变观察看到胰岛缩小，B细胞数量减少，从而导致胰岛素分泌合成量不足，使动物产生糖尿病，说明此建模方法是成功的。虽然已有大量报道有关STZ对胰岛B细胞的特异性杀伤作用,但具体机理目前尚不完全清楚。肖邦良等[4]通过实验发现，大鼠腹腔注入STZ后，变性的B细胞内溶酶体酶活性增高，而电镜观察却未见溶酶体数量增多，进而得出STZ对B细胞的毒作用是首先损伤细胞膜及有关细胞器膜结构，导致酶的扩散并产生酶活性的改变。还有学者[5]通过实验初步探讨STZ损伤胰岛B细胞的分子机制，认为STZ对B细胞的毒性作用是将其DNA碱基的特殊位点烷基化，再进一步作用于ADP核糖体合成酶，导致多聚ADP―核糖体激活，胞内NAD+和ATP耗竭，从而使大量反应性氧蔟产生，对B细胞产生损伤作用。近年来又有研究表明糖尿病发生和中，胰岛B细胞凋亡起着重要的作用，STZ可能通过诱导细胞凋亡的方式特异性损伤胰岛B细胞[6,7]。本实验建立速发型大鼠糖尿病模型过程中通过观察胰岛病理形态改变同样支持STZ直接破坏胰岛B细胞，使B细胞数量减少这一观点。STZ致糖尿病模型具有种属特异性，但就文献报道，在恒河猴、小鼠、豚鼠、Wistar大鼠中均能复制STZ糖尿病模型[8~10],并与我们所建立的SD大鼠糖尿病模型其胰岛结构的病理改变基本符合。除此之外，在本实验中，有10%注射STZ的SD大鼠建立糖尿病模型并未成功，从文献报道[11]来看，与一种抗氧化蛋白―金属硫蛋白Metallothionein(MT)作用有关，MT可在一些细胞中保护DNA免受化学损伤，因此在我们实验的一部分大鼠中（10%）造模失败，推测是由于MT的过表达能够保护B细胞的DNA免受损伤，从而阻止了STZ导致糖尿病，这方面工作有待进一步研究。同时，在建立糖尿病模型的过程中，有1%大鼠死亡。动物注射STZ后，不仅引起胰腺组织的病理改变，在心脏、肾脏、脾脏等多器官均可引起病理改变，死亡大鼠尿量逐渐减少，直至死亡，可能是由于多器官衰竭而导致，由于没有24h监护糖尿病大鼠，未得到一手资料，有待进一步尸检查证死因。一次性注射STZ造成速发型糖尿病大鼠模型应用比较多，对机体组织毒性相对较小，动物存活率还是较高的，方法简便，对胰岛B细胞损伤特异性高，是一种成模率高的途径，以往文献未提及造模失败的描述，我们的实验为客观评价STZ致糖尿病的机理及效果提供可靠的依据。

    文献

    1  方厚华.医学实验模型动物[M].北京：军事医学出版社,2002.5758

    2  赵凌云,钟成元,戴保民.链脲佐菌素实验性糖尿病研究[J],四川医学院学报,1985,16（4）：289291

    3  沈亚非,徐焱成.链脲佐菌素诱导实验性糖尿病模型建立的研究[J].实用诊断与杂志,2005,19（2）：7980

    4  肖邦良,彭琪毅,李琼英.链脲佐菌素所致大鼠胰岛组织病理及酶组织化学改变[J].四川医学院学报,1985,16（4）：295298

    5  Szkudelski J.The mechanism of alloxan and streptozotocin action in B cells of the rat pancreas[J].Physics Res,2001，50（6）：537546

    6  Mauricio D,MandrupPalsen T.Apoptosis and the pathogenesis of IDDM:a question of life and death[J].Diabetes,1998,47：1537

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    8  匡德宣,孙晓梅,江勤芳,等.实验性型糖尿病恒河猴的组织病观察[J].实验动物学报,2004,12（3）：174176

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    10杨丽萍,周文江,卫志明,等.链脲佐菌素诱发豚鼠糖尿病模型的研制[J].上海实验动物科学,2001,21(2):111112

    11Hainan C, Edward CC. Overexpression of Metallothionein in Pancreatic bCells Reduces StreptozotocinInduced DNA Damage and Diabetes[J].Diabetes, 2001,50:20402046