乙肝患者MBL EXON I 54位基因频率检测

               作者：赵铁军 杨翠军 刘 芳 贾天军 张林西 安芳  

【摘要】  目的:检测健康人及慢性乙肝患者MBL基因Exon I 54位密码子点突变的情况。方法：对MBL 54位密码子基因突变采用PCR?RLFP检测法。结果:检测64例健康汉族人54位密码子的点突变情况，野生型(GGC/GGC)为44例，占68.8%；突变杂合型(GGC/GAC)为19例，占29.6%，突变纯合子型(GAC/GAC)为1例，占1.6%，基因频率分别为GGC为0.836；GAC为0.164。检测54例乙肝患者，野生型为21例，占38.89%；突变杂合型为32例，占59.26%，突变纯合子型为1例，占1.85%，基因频率分别为GGC为0.6852；GAC为0.3148，健康人及慢性乙肝患者MBL基因54位密码子点突变有显著性差异，χ2=10.681 P=0.005(按基因型统计)；χ2=6.258 P=0.012(按基因统计)。结论：乙肝患者组较健康对照组MBL基因Exon I 54位密码子点突变频率显著升高，提示该项指标在乙肝发生机理中的作用应进一步研究。

【关键词】  甘露糖结合凝集素;聚合酶链反应;肝炎病毒/乙型;基因型

    【ABSTRACT】  Objective:To analyze the genotypes of MBL Exon I 54 in the healthy and patients with HBV infection.Methods:The situations of PCR?RFLP method was used to describe and detect genotypes of MBL Exon I 54.Results:The situations of genotypes of MBL Exon I 54 in 64 healthy cases were that 44 people(68.8%)were wildtype,19 people(29.6%)were heterozygous(wildtype and mutant)1 people was mutant occupying 1.6%,the genotypes of GGC and GAC  were 0.836 and 0.164 respectively.The situations of genotypes of MBL in 54 HBV infections were that 21 people(38.89%),32 people(59.26%)were heterozygous(wild?type and mutant),1 peoplewas mutant(1.85%),the genotype of GGC and GAC were 0.6852 and 0.3148.there was statistical significance between HBV infections and healthy(χ2=10.681,P=0.005(genotype),χ2=6.258 P=0.012(gene)).Conclusion:The results show that MBL genotypes influence recovery from hepatitis B virus infection and need to study deeply.

    【KEY WORDS】  Mannose?binding lectins;PCR;Hepatitis virus B;Genotype

    乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的肝脏炎性损害，本病在我国广泛流行，人群感染率高，是当前危害人类健康最严重的传染病之一。甘露糖结合凝集素（mannose?binding lectins，MBL）是一种由肝脏合成和分泌的急性时相蛋白，是Ca2+依赖性凝集素中胶凝素成员之一，广泛存在于肝脏及血液中。近年来研究表明MBL在机体免疫防御及监视中起重要作用，临床某些反复严重感染病症与血清中MBL水平低下及MBL基因突变有关[1～4]，以往的群体研究已发现MBL存在3种结构基因的变异型D、B、C，其突变位点均位于外显子1 ，分别为52（CGT→TGT）,54(GGC→GAC)及57(GGA→GAA)位密码子，并导致氨基酸的改变，影响了亚单位的空间结构和寡聚体的形成，从而形成无功能的蛋白。这样的蛋白大约95%被降解，所以具有变异型MBL的个体，其血清MBL水平低下，导致调理功能缺陷[5]。本实验的目的在于检测乙肝患者与健康对照者MBL基因Exon I 54位密码子点突变情况,研究根据MBL基因序列设计引物，测定健康汉族人及慢性乙肝患者MBL 基因Exon1 54位密码子点突变的情况，旨在通过分析这些因素的变化及相关性，为其辅助诊断和提供依据。

    1  材料与方法

    1.1  实验材料

    主要设备  低温高速离心机（德国，Hearus）；梯度PCR仪（德国，Eppendorf）；凝胶图像分析系统（珠海，黑马）；电泳仪（北京，六一），低温冰柜（美国，Thermo）

    主要试剂  TaqDNA聚合酶（5U/μL，PGK），10×Buffer（随酶增送），dNTP（Promega）,丙烯酰胺（Sigma），甲叉双丙烯酰胺（Sigma），红细胞裂解液，DNA提取液，TE缓冲液，电泳缓冲液，PCR Marker(100—600bp,广州东盛科技有限公司)

    1.2  实验方法

    1.2.1  标本的收集  自2005.12～2006.9月，收集来自张家口市中心血站经检验符合献血标准的健康献血员共64人的血液标本，女30人，平均年龄37.12±7.98岁；男34人，平均年龄37.57±8.37岁。慢性乙肝标本来自河北北方学院附属第一，经检验符合临床诊断标准，共54人，女26人，平均年龄38.68±8.70岁；男28人，平均年龄36.91±9.38岁。收集静脉血标本用EDTA?Na2抗凝（抗凝比例为10∶1），分离血浆，-80℃保存，供测定MBL含量，细胞成分用盐酸胍法提取DNA。

    1.2.2  染色体DNA的提取  取抗凝血的细胞成分200μL，用红细胞裂解液溶解红细胞，离心5000rpm 5min/次，弃上清，2次后，用生理盐水平衡，离心12000rpm 5min,去上清,采用胍盐酸法提取DNA,根据剩余体积依次加入不同体积的的提取液(包括7.5M胍盐酸、20mg/mL 10%十二烷基磺酸钠等)，70℃ 水浴10min,振荡混匀，再进行15min,离心收集上清,乙醇沉淀DNA，TE溶解,-20℃保存,供PCR用。

    1.2.3  PCR ?RFLP检测方法的建立

    1.2.3.1  引物设计与合成  根据MBL EXON I的DNA序列主要应用引物设计软件primer premier 5设计引物，由金思特科技有限公司合成。

    引物F为 5′?CAT CAA CGG CTT CCC AGG GCA AGA TTG G?3′;

    引物R为5′?GTC TCC TCA TAT CCC CAG GC?3′。

    1.2.3.2  扩增体系及参数设置如下  扩增体系为25μL,其中10×buffer 2.5μL,dNTP（2.5mmol/L）2μL，primer F（50pmol/L） 0.2μL,primer R（50pmol/L）0.2μL，TaqDNA酶0.2μL(5u/μL)，模板2μL 灭菌三蒸水补足总体积。预变性95℃ 5min，变性94℃ 10s、62℃ 30s、72℃ 30s（循环35次），72℃ 10min。

    1.2.3.3  扩增产物用限制性内切酶（Ban I）酶切  酶切体系为20μL ，其中：Ban I（10u/μL） 0.5μL，10×Buffer 2μL，DNA扩增产物17.5μL，37℃水浴反应1h，酶切产物用7%的PAG凝胶电泳，银染分析结果。DNA Marker作为参照，凝胶图像分析系统拍照，记录。

    1.3  PCR?RFLP检测方法的应用

    用上述建立的方法对所收集64例健康汉族人及54例慢性乙肝患者的Exon I 54 位密码子碱基突变进行分析。

    1.4  统计分析

    1.4.1  乙肝患者组、健康对照组MBL基因Exon I 54位密码子点突变频率的,通过简单数基因的方法得出。

    1.4.2  乙肝患者组、健康对照组MBL基因Exon I 54位密码子点突变频率的比较，采用两样本率比较的χ2检验。

    2  结果

    2.1  电泳分析结果显示酶切标本出现下列三种情况（图1）

    2.2  健康汉族人及慢性乙肝患者的Exon I 54 位密码子点突变频率

    检测64例健康汉族人54位密码子的点突变情况，野生型(GGC/GGC)为44例，占68.8%；突变杂合型(GGC/GAC)为19例，占29.6%；突变纯合子型(GAC/GAC)为1例，占1.6%。基因频率分别为GGC为0.836；GAC为0.164(见表1)。

    检测54例乙肝患者，野生型为21例，占38.89%；突变杂合型为32例，占59.26%；突变纯合子型为1例，占1.85%。基因频率分别为GGC为0.6852；GAC为0.3148(见表2)。表1  64例健康汉族人MBL外显子I 54位密码子点突变情况表2  54例慢性乙肝患者MBL外显子I 54位密码子点突变情况

    3  讨论

    人类MBL基因位于10q11.2?q21，由一个5启动子区域、四个外显子和三个内含子组成，编码产物为MBL，是一种由肝脏产生可溶性的C型凝集素，结构类似于C1q。MBL识别表达于病原体上的甘露聚糖和与其相似的糖基，从而通过调理吞噬作用和/或Lectin途径激活补体而导致其结构破坏，在机体的固有性免疫应答方面发挥重要作用。已经发现在5启动子区域有7个点突变,在Exon I有3个突变位点，编码区域上游突变会改变MBL的血清浓度，有可能使其产物不能够多聚化而进一步激活补体的MBL途径，因为MBL功能的发挥依赖于合适的MBL单体的多聚化水平，而MBL的血清水平和其结构则影响MBL功能的发挥。其中Exon I的52位（Arg?Cys 命名为等位基因D）、54位（Gly?Asp命名为等位基因B）和57位密码子（Gly?Glu，等位基因C）突变会干扰MBL多肽进一步组装成功能性多聚体，进而降低血清中功能性MBL的含量。而且研究发现其突变与许多疾病具有一定的相关性。有关MBL的检测方法有许多种，包括PCR?RFLP（restricted fragment length polymorphism）限制性片断长度多态性聚合酶链式反应、PCR?SSP（sequence specific primer polymerase chain reactions）序列特异性引物聚合酶链式反应 、SDM?PCR（site directed mutation）定点突变聚合酶链式反应以及PCR?SSOP（sequence specific oligonucleotide probe）序列特异性杂交探针聚合酶链式反应等方法。本文针对54位密码子设计的引物初步建立了检测方法即PCR? RFLP，用建立的该方法就北方地区收集的健康汉族人及慢性乙肝患者中的MBL 基因 Exon I 54位密码子的点突变情况进行调查、分析，在所检测到的64例健康汉族人中54位密码子的点突变情况，野生型(GGC/GGC)为44例，占68.8%；突变杂合型(GGC/GAC)为19例，占29.6%；突变纯合子型(GAC/GAC)为1例，占1.6%；基因频率分别为GGC为0.836，GAC为0.164。检测54例乙肝患者，野生型为21例，占38.89%；突变杂合型为32例，占59.26%；突变纯合子型为1例，占1.85%；基因频率分别为GGC为0.6852，GAC为0.3148，乙肝患者组较健康对照组MBL基因54位密码子点突变频率显著升高，上述结果与资料较符合[6]，为个体罹患感染提供了线索，提示该项指标在乙肝发生机理中的作用应进一步研究。

【文献】
  1 赵铁军，贾天军.北方汉族人MBL ExonⅠ52位基因频率调查/[J/].免疫学杂志，2005,21（5)：345?346

2 赵铁军，韩瑞，罗强.汉回蒙古族人MBL EXON I 52位基因频率检测及其意义/[J/].广东医学，2005,26（5）：608?609

3 赵铁军，贾天军，程建君.检测MBL EXON I 52位密码子突变PCR?SSP方法的建立/[J/].国外医学临床生物化学与检验学分册,2004,25 （5）：396?398

4 贾天军,李萍,张庶民,等.MBL ExonI 54位基因突变检测方法的建立及初步应用/[J/].中国生物制品学杂志,2003,16(6):327?329

5 贾天军,李萍,张庶民，等.汉、蒙古族人MBL基因Exon I 54位密码子点突变频率及其血浆含量相关性研究/[J/].中华微生物学和免疫学杂志,2004,24(2):115?119

6 Chloe L,Timothy M,Jacquie A,et al.Mannose binding lectin genotypes influence recovery from hepatitis B virus infection/[J/].J Virol,2005,79(14):9192?9196