脑力智宝对学习记忆障碍模型小鼠的保护作用

【摘要】  【目的】观察脑力智宝对学习记忆障碍模型小鼠的保护作用。【方法】（1）选用NIH小鼠32只随机分成假手术组，模型组，脑力智宝低、高剂量组（剂量分别为4、8g·kg-1·d-1）；除假手术组外，其他各组小鼠均进行脑缺血再灌注损伤造模，中药组小鼠连续灌胃给药10d后，采用跳台法观察小鼠的学习记忆能力，检测脑组织中丙二醛（MDA）与一氧化氮（NO）的含量、超氧化物歧化酶（SOD）与谷胱甘肽过氧化物酶（GSH?Px）的活力，高效液相色谱法检测大脑皮质中游离氨基酸的含量。（2）9月龄NIH小鼠40只随机分成正常对照组，拟衰老模型组，脑力智宝低、高剂量组（剂量分别为4、8g·kg-1·d-1)；除正常对照组外，其他组均腹腔注射50g/LD?半乳糖0.5mL连续6周，复制拟衰老模型，同时灌胃给药连续6周后，采用跳台法测试小鼠的学习记忆功能，检测大脑皮质单胺类神经递质去甲肾上腺素（NE）、肾上腺素（E）及5?羟色胺（5?HT）的合成前体物质色氨酸（TP）的含量。【结果】（1）脑力智宝能显著提高脑缺血再灌注损伤小鼠的记忆能力（P＜0.01），降低小鼠脑组织中MDA、NO、谷氨酸（Glu）的含量（P＜0.05），提高SOD及GSH?Px的活力（P＜0.05或P＜0.01）。（2）脑力智宝能显著改善拟衰老模型小鼠的学习记忆能力（P＜0.05或P＜0.01），提高大脑皮质NE、E及TP的含量（P＜0.05或P＜0.01）。【结论】脑力智宝可以通过提高机体抗氧化酶活性，清除自由基，抑制兴奋性氨基酸与NO的神经毒性作用，调节大脑皮质单胺类神经递质含量等多种途径改善学习记忆功能。

【关键词】  脑力智宝/药； 学习记忆障碍/中药疗法； 自由基； 单胺类神经递质； 疾病模型，动物； 小鼠

脑力智宝主要用于精神发育迟滞、脑瘫、癫痫、脑血管病后遗症、脑外伤后遗症、脑炎后遗症、老年性痴呆等脑病伴发的智力和肢体功能障碍，临床研究表明［1］脑力智宝能明显改善脑梗死后遗症患者运动、语言及精神方面的症状。本文观察了脑力智宝对脑缺血再灌注损伤所致学习记忆障碍小鼠与D?半乳糖所致拟衰老学习记忆障碍小鼠的影响，旨在阐明脑力智宝改善学习记忆功能的机理。现报道如下。

    1  材料与方法

    1.1  实验药物  脑力智宝由广东高明脑病医疗医药研究院提供，批号：990215，脑力智宝原药粉加12倍量的水浸泡1h，蒸馏提取挥发油3h，4 000r/min离心10min，药液作为一煎；药渣加入10倍量的水煎1h，4 000r/min离心10min，药渣弃去，合并2次药液，水浴浓缩成含生药1g/mL，挥发油加入适量吐温-80助悬，加入水煎液中拌匀，灌胃前按所需浓度稀释。

    1.2  动物  （1）清洁级NIH健康小鼠，雌雄兼半，32只，体质量25～30g，由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号：99A037；清洁级NIH健康小鼠，9月龄，雄性，40只，由广东省卫生厅实验动物场提供，合格证号：99A069。

    1.3  试剂  D?半乳糖为上海试剂二厂产品，批号970722；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH?Px）、一氧化氮（NO）、总蛋白试剂盒均为南京建成生物工程研究所产品；谷氨酸（Glu）、天门冬氨酸（Asp）、甘氨酸（Gly）、γ?氨基丁酸（GABA）、邻苯二甲醛（OPA）、3?巯基丙酸、去甲肾上腺素（NE）、肾上腺素（E）与色氨酸（TP）均为SIGMA公司产品。

    1.4  仪器  直径为30cm的圆形有机玻璃回避反应箱，箱底铺有铜栅，可以连接刺激电流，电压为30V，箱内一角设一直径和高均为5cm的绝缘橡皮塞为安全区；722光栅分光光度计为上海第三分析仪器厂产品；HP1050型高效液相色谱仪为惠普公司产品。

    1.5  脑力智宝对脑缺血再灌注损伤所致学习记忆障碍小鼠的作用

    1.5.1  小鼠脑缺血再灌注损伤模型复制［2］  24只小鼠经100g/L乌拉坦1g/kg腹腔注射麻醉后，颈正中切口分离双侧颈总动脉，以无损动脉夹夹闭15min后再通15min，再次夹闭15min。第1次缺血同时放血0.5mL造成低血压，缺血过程保持小鼠体温于36℃左右。8只假手术组小鼠操作同模型组，但不夹闭动脉，不放血。

    1.5.2  分组给药  24只脑缺血再灌注损伤小鼠无一只死亡，苏醒后按体质量随机分为模型组，脑力智宝低、高剂量组（中药低、高剂量组），每组8只；后2组分别给予脑力智宝药液4、8g·kg-1·d-1，假手术组和模型组分别给予等容积生理盐水。各组动物均按20mL/kg灌胃，每日1次，连续10d。

    1.5.3  小鼠学习记忆能力测试（跳台法）［3］  各组小鼠在末次给药2h后进行跳台训练。训练开始时，先将小鼠放入圆形回避反应箱内熟悉环境2～3min，轻放于平台上，当动物从跳台上跳下四肢接触铜栅时，即给予30V电压刺激，记录小鼠逃避至平台上的潜伏期，并记录5min内的触电次数（错误次数），以此作为学习能力的评价指标。24 h后测试，将小鼠置平台上，记录其第1次跳下受电击的时间（潜伏期）及其3 min内的触电次数（错误次数），以此作为记忆能力的评价指标。测试时，若小鼠在平台上超过3min，其潜伏期即以180s计。

    1.5.4  生化指标检测  小鼠在进行学习记忆能力测试后脱颈椎法处死，迅速取出脑组织。取左侧脑组织称质量后，用预冷的生理盐水制成1∶10（m/v）的匀浆，3 000r/min离心10min，取上清液，采用黄嘌呤氧化酶法测SOD酶活力，硫代巴比妥酸法测MDA含量，5，5?二硫对硝基苯甲酸（DTNB）直接法测GSH?Px酶活力，硝酸还原酶法测NO含量，并用Lowry法测定脑匀浆中的组织蛋白含量，测定步骤按试剂盒说明书进行。小鼠右侧大脑皮质准确称质量后，在冰浴中加入甲醇制成1∶20（m/v）匀浆，5 000r/min，4 ℃离心15min，收集上清液，同法再提取2次，合并3次提取的上清液，用邻苯二甲醛柱前衍生反相高效液相色谱法［4］测定其中游离的Glu、Asp、Gly、GABA的含量。

    1.6  脑力智宝对D?半乳糖所致拟衰老学习记忆障碍小鼠的作用

    1.6.1  分组给药与学习记忆能力测试  将9月龄小鼠按体质量随机分为4组：正常对照组，D?半乳糖致拟衰老模型组，脑力智宝低、高剂量组（中药低、高剂量组），每组10只。模型组和中药低、高剂量组小鼠每天腹腔注射50g/LD?半乳糖0.5mL，连续6周［5］；正常对照组每天腹腔注射等容积生理盐水；同时，中药低、高剂量组分别给予脑力智宝药液4、8g·kg-1·d-1，正常对照组和模型对照组分别给予等容积的生理盐水，各组动物均按20mL/kg灌胃，每天1次。6周后，于给药后2h采用跳台法进行学习记忆能力测试。

    1.6.2  脑内NE、E、TP含量检测［6］  跳台法测试结束后处死小鼠，迅速断头取脑，于冰浴中取大脑皮质0.3～0.4g，采用高效液相电化学法测定脑内NE、E及5?HT合成的前体物质TP的含量。

    1.9  统计学方法  采用SPSS 10.0统计软件进行统计学处理。计量资料用One?way?ANOVA，多组间两两比较用LSD（least?signficant?difference）统计。

    2  结果

    2.1  脑力智宝对脑缺血再灌注损伤所致学习记忆障碍小鼠的作用

    2.1.1  脑力智宝对脑缺血再灌注损伤小鼠学习记忆能力的影响  表1结果表明，与假手术组比，造模后的小鼠学习记忆能力下降，训练时逃避至平台的潜伏期显著延长（P＜0.01），测试时在平台上停留的潜伏期显著缩短（P＜0.01），错误次数显著增多（P＜0.05）；与模型组比，中药高剂量组可显著减少错误次数（P＜0.05），低剂量脑力智宝对小鼠的学习能力虽然有一定的改善作用，但差异无显著性意义（P＞0.05）；脑力智宝低、高剂量组均能显著改善小鼠的记忆能力（P＜0.01）。表1  各组对脑缺血再灌注损伤小鼠学习记忆能力的影响 ①Ｐ＜0.05，②P＜0.01，与假手术组比较；③Ｐ＜0.05，④P＜0.01，与模型组比较

    2.1.2  脑力智宝对脑缺血再灌注损伤小鼠脑组织中MDA、NO含量及SOD、GSH?Px活力的影响  与假手术组比较，脑缺血再灌注损伤小鼠脑组织中MDA、NO含量显著升高（P＜0.05），SOD、GSH?Px活力显著下降（P＜0.01）；与模型组比较，除中药低剂量组对MDA含量无显著影响外（P＞0.05），中药低、高剂量组均能显著降低脑组织中MDA、NO含量（P＜0.05），提高SOD、GSH?Px活力（P＜0.05或P＜0.01），结果见表2。

    2.1.3  脑力智宝对脑缺血再灌注损伤小鼠脑内游离氨基酸含量的影响  与假手术组比较，脑缺血再灌注损伤小鼠脑组织中Glu含量显著升高（P＜0.05），而Asp、GABA、Gly含量均无显著变化（P＞0.05）；与模型组比较，中药低、高剂量组小鼠脑内Glu含量显著降低（P＜0.05），而对Asp、GABA、Gly含量无显著影响（P＞0.05），结果见表3。

    2.2  脑力智宝对D?半乳糖所致拟衰老模型小鼠学习记忆障碍的作用

    2.2.1  脑力智宝对拟衰老模型小鼠学习记忆能力的影响  与正常对照组比较，造模后的小鼠学习记忆能力下降，训练时逃避至平台的潜伏期显著延长（P＜0.05），测试时在平台上停留的潜伏期显著缩短（P＜0.05），错误次数显著增多（P＜0.01）。与模型组比较，脑力智宝低、高剂量组均能显著改善模型小鼠的学习记忆能力（P＜0.05或P＜0.01），结果见表4。

    2.2.2  脑力智宝对拟衰老模型小鼠大脑皮质单胺类神经递质含量的影响  与正常对照组比较，拟衰老模型小鼠大脑皮质NE、E含量显著降低（P＜0.01），TP含量则无显著变化（P＞0.05）。与模型组比较，脑力智宝低、高剂量组小鼠大脑皮质NE、E水平显著升高（P＜0.01），TP含量也显著升高（P＜0.05或P＜0.01），结果见表5。表2  各组对脑缺血再灌注损伤小鼠脑组织内SOD、GSH?Px活力及MDA、NO含量的影响①Ｐ＜0.05，②Ｐ＜0.01，与假手术组比较；③P＜0.05，④Ｐ＜0.01，与模型组比较 表3  各组对脑缺血再灌注损伤小鼠脑内Glu，Asp，Gly与GABA含量的影响 ①Ｐ＜0.05，与假手术组比较；②P＜0.05，与模型组比较表4  各组对拟衰老模型小鼠学习记忆能力的影响 ①Ｐ＜0.05，②P＜0.01，与正常对照组比较；③Ｐ＜0.05，④P＜0.01，与模型组比较表5  脑力智宝对拟衰老模型小鼠大脑皮质单胺类神经递质含量的影响①Ｐ＜0.01，与正常对照组比较；②P＜0.05，③P＜0.01，与模型组比较

    3  讨论

    脑缺血损伤的机制与细胞间液兴奋性氨基酸（EAA）浓度升高、N?甲基?D天门冬氨酸受体（NMDA）激活、一氧化氮合酶（NOS）过度表达、一氧化氮（NO）生成过多、氧自由基（OＦR）大量产生以及细胞内Ca2+超载等因素有关［7-8］。在脑缺血时，自由基生成增加，防御机制活性降低，自由基作用于多价不饱和脂肪酸，发生氧化反应，诱导DNA、RNA、蛋白质的交联和氧化反应，促使多糖分子聚合，从而损伤脑组织，出现结构及功能的改变［7］。脑缺血时大量的NMDA受体激活，细胞内钙增多，Ca2+与钙调蛋白（CaM）结合激活NO合酶（NOS），合成大量NO，过量的NO扩散作用于邻近神经元，促进兴奋性氨基酸的释放与自由基的形成，造成神经元坏死和凋亡［8］。因此在脑缺血时，ODR、EAA、Ca2+、NO四者相辅相成，相互促进，形成恶性循环，破坏中枢神经的正常结构，影响包括学习记忆在内的各种中枢神经系统功能。

    中枢胆碱能系统是学习记忆的重要机制，同时中枢胆碱能功能也部分依赖于完整的前脑NE和5?羟色胺（5?HT）系统的功能。单胺类神经递质对记忆的形成和维持起着很重要的作用，脑内NE系统调节觉醒、选择性注意和应激反应；5?HT系统调节情感、动机和食欲等，通过这些机制，能使动物学习记忆能力处于“易化状态”或“易损状态”［9］。

    脑力智宝主要由当归、红花、远志、石菖蒲、黄精、益智仁、龟板、枸杞子、核桃仁等组成。方中当归、红花养血活血，破瘀散结；石菖蒲、远志化痰开窍；黄精、益智仁益气健脾；龟板、枸杞子、核桃仁平补肾阴肾阳，益髓填精。药理研究资料表明：当归能抑制Bax蛋白的表达，减少脑缺血区细胞凋亡的发生［10］；红花注射液可以减少脑梗死体积，在脑缺血损伤急性期可增加神经元凋亡相关蛋白Bcl?2的表达而减少caspase?3的表达［11］；远志、黄精、益智仁能够改善学习记忆功能［12-14］；石菖蒲可通过增强突触可塑性，改善痴呆大鼠的学习记忆功能［15］，石菖蒲挥发油可以有效抑制脑缺血—再灌注后兴奋性氨基酸Glu、Asp、GABA含量的异常升高，抑制大鼠脑皮质和海马神经细胞bax基因表达，增强bcl?X基因的表达，从而抑制大鼠神经细胞凋亡，减轻神经细胞的损伤［16-17］。既往研究［1８］表明脑力智宝可以通过抗氧化作用、Ca2+拮抗作用、促进Bcl?2蛋白的表达和调节细胞膜的流动性，从而抑制NO诱导的PC12细胞凋亡。血清药的体外实验研究［１９］表明脑力智宝提取物及其含药血清可拮抗谷氨酸和一氧化氮引起的神经毒性作用。

    本实验观察了脑力智宝对脑缺血再灌注损伤所致学习记忆障碍小鼠与D?半乳糖致拟衰老学习记忆障碍小鼠的影响，小鼠脑缺血再灌注后学习记忆能力显著下降，脑组织内氧化产物MDA、Glu及NO的含量显著升高，而抑制自由基生成的GSH?Px和SOD的活性则显著降低。经脑力智宝后，记忆能力显著提高，MDA、Glu、NO含量降至正常水平，GSH?Px、SOD活性亦恢复正常。研究提示脑力智宝能减少自由基的形成，抑制兴奋性氨基酸及NO的神经毒性作用，从而抑制脑缺血损伤所致的神经细胞坏死及细胞凋亡，减少细胞丢失，保持损伤后的脑组织结构完整，学习记忆等功能才得以改善。脑力智宝也能显著改善D?半乳糖致拟衰老模型小鼠的学习记忆能力，提高大脑皮质单胺类神经递质NE、E及5?HT的合成前体TP的含量，提示脑力智宝可以通过调节单胺类神经递质系统改善学习记忆功能。本研究为脑力智宝用于治疗脑缺血损伤性疾病与老年性痴呆等退行性疾病伴发的学习记忆障碍提供了实验依据。

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