表皮生长因子受体特异性单链抗体的筛选及初步鉴定

               作者：赵晓蓉，戴文涛，王敏，彭吉林，黄韬，王国斌，伍钢，沈关心

【摘要】  目的 从大型人源抗体库Griffin 1中直接筛选出靶向EGFR的单链抗体。方法 以稳定转染的CHO?EGFR?GFP1细胞和未转染的CHO?K1细胞分别作为EGFR阳性和阴性细胞，采用负筛选的方法进行筛选；通过比较每轮投入及洗脱出噬菌体的效价比以及细胞ELISA检测多克隆p?scFv与阳性、阴性细胞结合情况对筛选过程进行监测；采用菌落PCR挑选含有全长scFv片断的菌落，进一步用细胞ELISA检测单克隆p?scFv与EGFR阳性及阴性细胞结合特异性；挑选EGFR特异性单克隆p?scFv采用DNA测序法确定克隆多样性。结果 经过5轮筛选，细胞裂解液中洗脱出噬菌体效价有500倍以上增长；细胞ELISA结果显示多克隆p?scFv与CHO?EGFR?GFP1细胞和CHO?K1细胞均有明显结合，但有部分特异性结合EGFR；菌落PCR显示约45％克隆中含有完整的1kb scFv片断；经细胞ELISA、 DNA测序检测共获得1株EGFR特异性单链抗体，命名为F4?scFv。结论 F4?scFv可与筛选中所用EGFR阳性细胞特异性结合，为进一步研制以此单链抗体为靶向分子的抗肿瘤药物奠定了基础。

【关键词】  表皮生长因子受体；抗体库；单链抗体；肿瘤靶向

　　Abstract:Objective To Select an epidermal growth factor receptor (EGFR) scFv from a large nonimmune phage display library. Methods  CHO?EGFR?GFP1, a transfected cell line expressing EGFR?GFP fusion protein on membrane, and the untransfected cell line CHO?K1 were used as EGFR positive cells and negative cells respectively in the subtractive selection procedure. The efficiency of selection was monitored by comparing the number of phage recovered from the acid elution and cell lysate in each round，and by testing EGFR binding specificity of polyclonal phage?scFv (p?scFv) on CHO?EGFR?GFP1 and CHO?K1 cell with cell ELISA. Bacterial PCR was used to select clones containing a 1 kb insert. Cell ELISA was used to determine EGFR binding specificity of monoclonal p?scFv on EGFR positive and negative cell. The number of individual EGFR?binding clones was determined with nucleotide sequencing. Results  500?fold enrichments were observed by tittering phages in the cell lysate after five rounds of selection. A signal significantly greater than background binding was observed from the third to the fifth round of selection on CHO?EGFR?GFP1 and CHO?K1 cell, but a part of polyclonal scFv bound EGFR specially. About 45% of the selected clones contained a full?sized insert of 1 kb. One unique human anti?EGFR scFv (F4?scFv) was isolated by analyzing with cell ELISA and DNA sequencing. Conclusion  F4?scFv binds specifically to EGFR positive cell line used in the selection, this work will be a fundament for further developing of anti?tumor drugs using this scFv as target molecule.

　　Key words: EGFR; antibody library; scFv; tumor targeting

　　利用抗体将分子（毒素、治疗基因）直接运送到肿瘤细胞内发挥作用是一种重要的肿瘤靶向治疗策略［1］。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）高表达于多种恶性肿瘤细胞, 包括头颈癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、直肠癌、前列腺癌及膀胱癌等，EGFR已成为肿瘤靶向生物治疗的一个理想靶点。本研究前阶段工作以建立膜表面稳定EGFR的CHO?EGFR?GFP1细胞［2］，本部分研究将以此转染的细胞为阳性细胞、未转染的CHO?K1细胞为阴性细胞，拟从大型人源抗体库Griffin 1中直接筛选出靶向EGFR的单链抗体（single chain variable fragment，scFv），为研究靶向EGFR的抗肿瘤治疗药物奠定基础。

　　1材料与方法

　　1.1材料
    　　
　　仓鼠卵巢细胞CHO?K1以及稳定转染细胞系CHO?EGFR?GFP1［将含有全长EGFR  cDNA的载体pEGFR?EGFP（由德国哥廷根Max Planck研究院Thomas M. Jovin教授惠赠）转染CHO?K1细胞而获得［2］］由华中科技大学免疫学系保存，培养于含10％（φ）小牛血清的RPMI 1640培养基中。
    　　
　　Griffin 1抗体库由英国剑桥大学蛋白质工程中心Greg Winter教授惠赠，为将scFv基因与编码噬菌体外壳蛋白Ⅲ基因相连并克隆到pHEN2噬粒载体上获得，按说明书操作。mouse anti?M13 mAb (Amersham)，辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的 rabbit?anti?mouse IgG (KPL)。

　　1.2方法

　　1.2.1EGFR特异性单链抗体的筛选CHO?EGFR?GFP1于75 mL细胞培养瓶中培养至80%～90%饱和。1 mL噬菌体抗体库（1×1012 cfu，溶于3 mL完全培养基中）首先与5×106 CHO?K1细胞4 ℃孵育1 h，离心收集抗体库再与CHO?EGFR?GFP1细胞4 ℃孵育1 h。细胞用4 ℃完全培养基洗6次，然后加入37℃预温的完全培养基于37℃、5% CO2培养箱孵育30 min。细胞膜表面结合的噬菌体用冷的甘氨酸缓冲液（500 mmol/L NaCl, 0.1 mol/L glycine, pH 2.5）4 ℃洗脱3次，每次10 min，然后用PBS洗6次。细胞用胰蛋白酶消化，PBS洗2次，离心收集细胞，用1 mL 100 mmol/L  TEA 裂解10 min，然后用0.5 mL 1 mol/L  Tris?cl （ pH 7.4）中和。用TEA裂解物感染指数生长期大肠杆菌TG1以扩增噬菌体?scFv（p?scFv）并用于下一轮筛选。共进行5轮筛选。比较每轮投入及洗脱出噬菌体的效价比对筛选过程进行监测。

　　1.2.2菌落PCR挑取单个菌落裂解于20 μL 0.1% Triton X?100，取1 μL细菌裂解物作为模板。上游引物为PHEN?seq (5’?CTATGCGGCCCCATTCA?3’)，下游引物为LMB3 (5’?CAGGAAACAGCTAT GAC?3’)。反应条件：95 ℃预变性9 min，95 ℃变性45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30个循环。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，挑选含有1 kb片段的克隆供进一步分析。

　　1.2.3细胞ELISA多克隆及单克隆p?scFv分别采用细胞ELISA检测其与EGFR结合的特异性。CHO?EGFR?GFP1及CHO?K1细胞分铺于96孔V型底细胞培养板（5×105 细胞/孔），1 500 r/min离心5 min，加入100 μL p?scFv（2倍稀释于PBS/6% BSA）4 ℃孵育1 h。细胞用冷的PBS/1% BSA洗3次，加入mouse anti?M13 mAb 4 ℃ 孵育30 min。细胞用冷的PBS/1% BSA洗3次，加入HRP标记的 rabbit?anti?mouse IgG 4 ℃ 孵育30 min。细胞用冷的PBS/1% BSA洗3次，加入OPD底物缓冲液，2M硫酸终止反应，酶标仪检测A405－A630值。采用M13辅助噬菌体作为阴性对照。

　　1.2.4DNA测序将筛选出的单克隆菌送交上海搏亚生物公司采用引物PHEN?seq、LMB3测序，并用核酸蛋白质分析软件DNAPLOT和V?BASE对单链抗体重链、轻链可变区DNA序列进行分析。

　　1.2.5统计学分析利用SAS软件对数据进行分析，采用配对t检验，以P<0.05为差异有显著性。

　　2结 果

　　2.1每轮筛选噬菌体效价检测　
    　　
　　经过5轮筛选，酸性洗脱液中噬菌体效价有15倍富集，而细胞裂解液中噬菌体效价有500倍以上增长（表1），说明内吞性噬菌体得到富集。
　　
　　表1每轮筛选噬菌体效价检测　略

　　2.2单克隆菌PCR扩增产物鉴定
    　　
　　报道［3］所用抗体库中部分噬粒不含有1 kb完整单链抗体插入片段，因此从第5轮筛选细胞裂解液所铺平皿中挑取单克隆菌进行PCR检测。共挑取300个单克隆菌，结果约45%含有1 kb完整片断（图1）。

　　图1单克隆菌PCR扩增产物电泳鉴定　略

　　2.3p?scFv与细胞结合特性
    　　
　　筛选还通过细胞ELISA检测每轮筛选扩增后多克隆p?scFv与EGFR阳性及阴性细胞结合差异进行监测。由图2中可见，从第3轮筛选开始，多克隆p?scFv与CHO?EGFR?GFP1细胞结合明显增强，与CHO?K1细胞结合也有增强，但弱于CHO?EGFR?GFP1细胞。表明大多数p?scFv结合于两细胞上共同抗原，但也有部分p?scFv特异性结合于CHO?EGFR?GFP1细胞。
    　　
　　对PCR检测含有1 kb完整单链抗体插入片段的单克隆p?scFv经细胞ELISA检测，发现有4个单克隆p?scFv与CHO?EGFR?GFP1细胞特异性结合，而不与CHO?K1细胞结合。
    　　 　
　　表3次实验结果的平均值与相应对照比较　略

　　2.4单链抗体DNA序列分析
   
　　DNA序列分析结果显示，4个EGFR特异性单克隆有3个其DNA序列完全一样，另一个其DNA序列仅有个别碱基与前3个存在差异，但都可以被翻译成完全一致的单链抗体，因此将其统一命名为F4?scFv，并登录Genbank（登录号码: DQ666353）。序列分析显示F4?scFv VH属于VH3家族，而VL属于VL1家族。

　　3讨 论
    　
　　抗体库技术是将人抗体全套可变区基因克隆出来连接到有关载体上，导入受体菌系统，利用受体菌蛋白合成分泌等条件，将这些基因表达在细菌、噬菌体等的表面，以利于筛选与扩增。这种技术的出现使人源抗体的获得变得更加容易，利用这种技术，人们可以从抗体库中经过几轮筛选直接得到针对目的抗原的人源抗体，无需免疫动物，免却了杂交瘤技术的耗时费力之苦，并使一些以常规方法难以获得的针对人自身的以及毒素等的抗体能够直接从噬菌体抗体库中筛选出来。
    　　
　　抗体库筛选可以用纯化的抗原或者细胞裂解液筛选，但是这往往导致筛选出来的抗体不能识别天然细胞上的抗原［4］。本研究中采用负筛选的方法直接用活的细胞筛选，先将抗体库与抗原阴性细胞孵育，除去与阴性细胞表面抗原结合的部分，然后让剩余的抗体库与抗原阳性细胞孵育，并在37 ℃使EGFR内吞，洗脱时先用酸性缓冲液洗掉与细胞表面结合的抗体，再裂解细胞获取内吞的单链抗体扩增后用于下一轮筛选。采用这种筛选方法利用了细胞表面受体的生物学活性，将可能产生具有生物学功能的单链抗体，比如能触发受体内吞、介导细胞黏附转移等［5，6］。而且由于筛选洗脱条件更严格，将有可能提高筛选效率。
    　　
　　本研究中所采用的抗体库为大型人源半合成抗体库，含有109个克隆。我们以稳定转染的细胞系CHO?EGFR?GFP1细胞作为EGFR阳性细胞，而未转染CHO?K1细胞为阴性细胞，这2株细胞除了EGFR的表达不同之外完全相同，因此在负筛选中以及筛选后对单链抗体特异性的鉴定中都是一对理想的细胞对，加快了获得抗体的进程，与CHO?EGFR?GFP1细胞结合而不与CHO?K1细胞结合的单链抗体就应是EGFR特异性的。但是由于转染的细胞通常表达目的抗原水平较低，在筛选中将转染细胞作为阳性细胞也降低了筛选的效率，我们以及其他研究者的结果均显示筛选出的大部分p?scFv均与两细胞表面共同抗原结合［7］。（下转第198页）(上接第194页)本研究从大型人源抗体库Griffin.1中成功获得了单链抗体F4?scFv，并对其与EGFR结合的特异性进行了初步鉴定，进一步进行流式细胞仪和免疫印迹检测，结果显示F4?scFv不仅能与筛选中所用EGFR阳性细胞结合，还能与天然表达EGFR的细胞特异性结合［8］。F4?scFv可被用作载体运送药物到肿瘤细胞，而且由于其人源性，对人将无免疫原性。

【文献】
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