槟榔提取物体外诱导人口腔黏膜成纤维细胞增殖模型的建立

                     作者：谭劲，李元聪，陈明，陈安，彭楚湘

【摘要】  目的 为研究口腔黏膜下纤维化的修复机制，建立体外人口腔黏膜成纤维细胞增殖模型。方法 体外培养口腔黏膜成纤维细胞，并用波形蛋白、角蛋白免疫细胞化学方法鉴定；分别用０、５、５０、１００、１５０、２００ μｇ／ｍＬ浓度的槟榔提取液对培养的成纤维细胞诱导，ＭＴＴ法检测细胞增殖。结果 波形蛋白表达阳性，而角蛋白表达阴性；５０、１００ μｇ／ｍＬ槟榔提取物促进口腔黏膜成纤维细胞增殖。结论 培养的细胞为纯化的成纤维细胞，槟榔提取物诱导口腔黏膜成纤维细胞增殖的最佳浓度为５０～１００ μｇ／ｍＬ。该模型可为进一步的研究提供实验基础。

【关键词】  槟榔提取物；口腔黏膜；成纤维细胞；增殖

    〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｐｒｏｖｉｄｅ ａ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｏｒａｌ ｍｕｃｏｓａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｒｅｐａｉｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｎ ｏｒａｌ ｓｕｂｍｕｃｏｕｓ ｆｉｂｒｏｓｉｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｈｕｍａｎ ｏｒａｌ ｍｕｃｏｓａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｗｅｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｖｉｍｅｎｔｉｎ ａｎｄ ｋｉｅｒａｔｉｎ ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｍｅｔｈｏｄ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｗｅｒｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ａｒｅｃａ ｎｕｔ ｅｘｔｒａｃｔ （ＡＮＥ） ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ （０，５，５０，１００，１５０ ａｎｄ ２００ μｇ／ｍＬ） ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ＭＴＴ ａｓｓａｙ． Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｖｉｍｅｎｔｉｎ ｗａｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｋｅｒａｔｉｎ ｎｅｇａｔｉｖｅ，ａｎｄ ＡＮＥ ｗｉｔｈ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ５０ μｇ／ｍＬ ａｎｄ １００ μｇ／ｍＬ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｄ ｔｈｅ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｏｒａｌ ｍｕｃｏｓａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，ｔｈｅ ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ＡＮＥ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｒａｌ ｍｕｃｏｓａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ａｒｅ ５０ μｇ／ｍＬ－１００ μｇ／ｍＬ． Ｔｈｉｓ ｍｏｄｅｌ ｃａｎ ｂｅ ａ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆａｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｏｒａｌ ｓｕｂｍｕｃｏｕｓ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｒｅｐａｉｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．

    〔Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ〕 ａｒｅｃａ ｎｕｔ ｅｘｔｒａｃｔ ｏｒａｌ ｍｕｃｏｓａ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ; ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ     口腔黏膜下纤维化（ｏｒａｌ ｓｕｂｍｕｃｏｕｓ ｆｉｂｒｏｓｉｓ，ＯＳＦ）是一种以胶原纤维堆积为主要病变特征的慢性、隐匿性疾病。大量的流行病学调查表明ＯＳＦ与咀嚼槟榔有密切的关系。成纤维细胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ，ＦＢ）是ＯＳＦ发病中的主要细胞，是口腔黏膜胶原蛋白合成的主要来源，其异常增殖在纤维化疾病形成过程中起非常重要的作用［１］，本实验拟建立槟榔提取物（ａｒｅｃａ ｎｕｔ ｅｘｔｒａｃｔ，ＡＮＥ）体外诱导人口腔黏膜ＦＢ增殖模型，旨在为口腔黏膜下纤维化修复机制的研究提供实验基础。现将实验方法及结果报道如下。

    １ 材料与方法

    １．１  材料

    １．１．１  药物  槟榔提取物（ＡＮＥ）按［２］制备，溶于无血清ＤＭＥＭ培养液，母液浓度１０ ｍｇ／ｍＬ，０．２２ uｍ滤器过滤除菌，４ ℃保存。

    １．１．２  试剂  ＤＭＥＭ （ＧＩＢＣＯ），无支原体胎牛血清（杭州四季青生物工程材料公司）；胰蛋白酶（Ｔｔｙｐｓｉｎ１：２５０）；噻唑蓝（ＭＴＴ）；二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）；ｓｉｇｍａ产品，鼠抗人波形蛋白单克隆抗体、广谱鼠抗人角蛋白单克隆抗体、ＳＰ免疫组化染色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

    １．１．３  仪器  二氧化碳培养箱（美国Ｓｈｅｌｄｏｎ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｉｎｃ）；超净工作台（苏州净化设备公司）；倒置相差显微镜（Ｍｏｔｉｃ）；ＭＫ３酶标仪（芬兰ＬＡＢＳＹＳＴＥＭＳ）；多管架自动平衡离心机（湖南天创仪器制造公司）。

    １．２  方法

    １．２．１  口腔黏膜组织块处理  来源于湖南中医药大学第一附属口腔颌面外科手术病人的颊部，要求病人无全身系统性疾病及近期用药史，颊黏膜正常无角化，标本取下后立即放入装有ＤＭＥＭ培养液（其中含１００ ＩＵ／ｍＬ青霉素，１００ μｇ／ｍＬ链霉素）的无菌玻璃瓶内备用，２ ｈ内处理组织。

    １．２．２  ＦＢ的原代培养  采用组织块培养法。新鲜黏膜用含双抗（１００ ＩＵ／ｍＬ青霉素，１００ μｇ／ｍＬ链霉素）的ＰＢＳ充分漂洗３次，去除血迹及坏死组织，将组织剪成约１ ｍｍ３大小的组织块，用数滴小牛血清湿润培养瓶底后，用牙科探针将组织块均匀置于瓶底，轻轻翻转培养瓶，使组织块处于悬浮状态，将培养瓶底朝上放置在３７ ℃，５％ ＣＯ２培养箱内。放置４～６ ｈ，待组织块贴附后，在瓶内加入１．５ ｍＬ ２０％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养液，将培养瓶慢慢翻转平放，静置培养２４ ｈ后，再往瓶中补加适量培养液。以后每３～４ ｄ换液１次，４～７ ｄ可见ＦＢ爬出组织块，１５～２０ ｄ进行第一次传代。

    １．２．３  口腔黏膜ＦＢ的传代及鉴定  待细胞融合面积达８０％～９０％进行第一次传代。０．２５％的胰蛋白酶消化２～３ ｍｉｎ，加入含１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养液终止消化，消化液１ ５００ ｒ／ｍｉｎ离心５ ｍｉｎ，弃上清，加入培养液吹打成细胞悬液，分装于培养瓶后加入含１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养液，按１∶２比例传代， ３～５ ｄ传代１次。将第３代ＦＢ接种于６孔板中，内置预先经明胶处理过的玻片，待细胞融合后，４％多聚甲醛室温固定细胞３０ ｍｉｎ，ＳＰ法进行细胞免疫化学染色，一抗为鼠抗人波形蛋白单克隆抗体，鼠抗人广谱角蛋白抗体作为阴性对照，实验步骤按ＳＰ免疫组化染色试剂盒进行，ＤＡＢ显色，常规脱水透明，中性树胶封片。光学显微镜下观察结果。

    １．２．４  ＡＮＥ刺激口腔黏膜ＦＢ增殖及其鉴定  取第３～４代口腔黏膜ＦＢ，０．２５％胰蛋白酶消化细胞，将细胞悬于含１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养液中，血细胞计数板计数细胞，调整细胞密度为５×１０４／ｍＬ，接种于９６孔培养板中，每孔２００ μＬ，培养４８ ｈ后弃上清，无血清ＤＭＥＭ液洗１次，分成Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ ６组，每组６孔，分别加入含ＡＮＥ终浓度为０，５，５０，１００，１５０，２００ μｇ／ｍＬ的ＤＭＥＭ培养液，不含血清，每孔２００ μＬ，培养４８ ｈ后，每孔加入５ ｍｇ／ｍＬ的ＭＴＴ液２０ μＬ， ３７ ℃继续培养４ ｈ后，中止培养，小心吸净孔内培养上清液，每孔加入１５０ μＬ ＤＭＳＯ，振荡１０ ｍｉｎ，选择４９０ ｎｍ波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果并重复２次。每组另设１孔只含培养液不含细胞的空白调零。

    １．２．５  统计学分析  应用ＳＰＳＳ １２．０统计软件进行分析，数据以“ｘ±ｓ”表示，多样本均数比较采用单因素（Ａ－ＮＯＶＡ）方差分析法，两样本均数比较用ｔ检验。

    ２ 结果

    ２．１  ＡＮＥ对培养细胞生物学特性的影响

    原代培养６ ｄ左右，可见组织块周围有细胞游出，呈长梭形，不规则的三角形或扇形，有数个长短不一的突起，胞核椭圆形位于胞体中央（图１①）。细胞经３次传代后纯化，ＦＢ细胞长满瓶底后，并不紧靠相连成片，而是排列成栅栏状、漩涡状、放射状（图１②）。抗波形蛋白抗体染色阳性，阳性率＞９９％，阳性表达位于胞浆，呈现与成纤维细胞长轴方向一致的棕黄色束状或网状结构（图１③）。抗角蛋白抗体染色阴性，表明ＦＢ培养成功，并排除了上皮细胞的污染（图１④）。

    ２．２  不同浓度ＡＮＥ对口腔黏膜ＦＢ增殖的影响

    不同浓度的ＡＮＥ作用于ＦＢ ４８ ｈ后，各浓度组ＯＤ值经方差分析，Ｆ＝１５．９２６，Ｐ＜０．０５，组间具有显著性差异，５０、１００ μｇ／ｍＬ浓度组与空白浓度组比较，Ｐ＜０．０５，具有显著性差异；２００ μｇ／ｍＬ浓度组与空白浓度组比较，Ｐ＜０．０５，具有显著性差异。提示在５０～１００ μｇ／ｍＬ的浓度范围内，ＡＮＥ促进口腔黏膜成纤维细胞的增殖；浓度为２００ μｇ／ｍＬ时抑制ＦＢ增殖。（见表１）。

    ３ 讨论

    在口腔黏膜组织中，主要含有两种细胞：上皮细胞和成纤维细胞。进行口腔黏膜细胞培养的过程中，就要考虑细胞的纯化的问题。生命力旺盛、增殖能力强是ＦＢ一个主要特征，在体外培养条件下，ＦＢ很容易“疯长”并抑制培养物中其它类型细胞的生长而成为培养物中的优势细胞群［３］。上皮细胞常用角蛋白做标记， ＦＢ常用波形蛋白标记，本实验２～３次传代后细胞波形蛋白染色阳性，而角蛋白染色阴性，结合细胞形态生长特性可以确认为纯化的ＦＢ。本实验采用ＭＴＴ法检测ＡＮＥ对口腔黏膜ＦＢ增殖的影响，结果表明槟榔提取物在低浓度下对细胞增殖无明显影响，在５０、１００ μｇ／ｍＬ时ＡＮＥ明显促进ＦＢ增殖，在２００ μｇ／ｍＬ时，ＡＮＥ对ＦＢ表现为抑制作用。

    近来的研究表明，ＦＢ是ＯＳＦ发病中的主要细胞，多数学者在研究ＯＳＦ发病机理时把ＦＢ作为主要的研究对象，ＦＢ主要合成和分泌胶原蛋白、弹性蛋白，生成胶原纤维，网状纤维和弹性纤维，也合成和分泌糖胺多糖（如ＨＡ）和糖蛋白（如ＦＮ、ＬＮ）等基质。组织炎症、增生纤维化时释放多种趋化因子，能促使ＦＢ聚集增殖合成胶原和非胶原基质成分，在组织增生、纤维化时起重要作用［４］。ＦＢ位于口腔黏膜下组织中，是口腔黏膜胶原蛋白合成的主要来源，而ＯＳＦ病变的实质是胶原纤维等细胞外基质合成增加和降减不足，在口腔黏膜下过度堆积。因此，ＦＢ在ＯＳＦ的形成中发挥着关键的作用。一些学者认为，槟榔所含生物碱在ＯＳＦ发病过程中起到直接或间接的作用［５，６］。一方面，在ＯＳＦ发生中，咀嚼槟榔等刺激直接作用于口腔黏膜下组织，使ＦＢ受刺激后，对上皮下与其接触的ＦＢ产生细胞毒作用，同时出现上皮下炎性反应，刺激ＦＢ、炎性细胞及上皮细胞等释放大量细胞外基质，主要是各种促生长因子，如ＴＧＦβ１、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＣＮＡ等，这些细胞因子形成一个，以自分泌或旁分泌方式调控ＦＢ增殖，促进其合成和分泌大量的胶原纤维，从而形成ＯＳＦ。组织培养也表明，槟榔中的生物碱能促进黏膜ＦＢ的增殖和胶原合成，所含鞣酸能够抑制胶原纤维的降解。另一方面，槟榔有效成分的刺激可使ＯＳＦ组织上皮细胞发生改变，表面受体被激活，分泌产生各种促生长因子等活性物质，这些物质又进一步作用于ＦＢ，诱导细胞增殖，胶原沉积而导致口腔黏膜纤维化。该模型可为进一步的研究提供实验基础。体外实验证明［７，８］，ＯＳＦ病变区炎症细胞产生的细胞因子和生长因子可以通过诱导口腔黏膜ＦＢ增殖以及胶原合成上调和胶原酶活性下调来促进纤维化。因此如何抑制成ＦＢ的增殖，拮抗和阻断对ＦＢ的异常促增殖作用，将成为ＯＳＦ防治的关键。

【】
  ［１］ 李秉琦．口腔黏膜病学．北京：人民卫生出版社，２００５：９８．

［２］ 李元聪，谭 劲，陈 安，等．丹玄口康对口腔黏膜下纤维化大鼠ＴＧＦβ１表达的影响．新中医，２００６，３８（１１）：８９－９１．

［3］ 薛庆善．体外培养的原理与技术．北京：出版社，２００３：４４２．

［4］ Ｔｓａｉ ＣＣ，Ｍａ ＲＨ，Ｓｈｉｅｈ ＴＹ． Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ｃｏｌｌａｇｅｎ ａｎｄ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｂｕｃｃａｌ ｍｕｃｏｓａ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｓ ａ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ｏｒａｌ ｓｕｂｍｕｃｏｕｓ ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｊ Ｏｒａｌ Ｐａｔｈｏｌ Ｍｅｄ． １９９９，２８（２）：５９－６３．

［5］ Ｍａ ＲＨ，Ｔｓａｉ ＣＣ，Ｓｈｉｅｈ ＴＹ． Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｌｙｓｙｌ ｏｘｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｆｒｏｍ ｏｒａｌ ｓｕｂｍｕｃｏｕｓ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｂｅｔｅｌ ｎｕｔ ｃｈｅｗｉｎｇ ｉｎ Ｔａｉｗａｎ． Ｊ Ｏｒａｌ Ｐａｔｈｏｌ Ｍｅｄ． １９９５，２４（９）：４０７－１２．

［6］ Ｈａｒｖｅｙ Ｗ，Ｓｃｕｔｔ Ａ，Ｍｅｇｈｊｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ ．Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｕｃｃａｌ ｍｕｃｏｓａ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙ ｂｅｔｅｌ－ｎｕｔ ａｌｋａｌｏｉｄｓ．Ａｒｃｈ． Ｏｒａｌ Ｂｉｏｌ． １９８６，３１（１）：４５－９．

［7］ Ｃｈｅｎ ＣＣ，Ｈｕａｎｇ ＪＦ，Ｔｓａｉ ＣＣ． Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｇｉｎｇｉｖａｌ，ｎｏｒｍａｌ ｂｕｃｃａｌ ｍｕｃｏｓａ，ａｎｄ ｏｒａｌ ｓｕｂｍｕｃｏｕｓ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｂｅｔｅｌ－ｎｕｔ ａｌｋａｌｏｉｄｓ．Ｇａｏｘｉｏｎｇ Ｙｉ Ｘｕｅ Ｋｅ Ｘｕｅ Ｚａ Ｚｈｉ． １９９５，１１（１１）：６０４－１４．

［8］ Ｈａｑｕｅ ＭＦ，Ｍｅｇｈｊｉ Ｓ，Ｎａｚｉｒ Ｒ，ｅｔ ａｌ． Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇａｍｍａ （ＩＦＮ－ｇａｍｍａ） ｍａｙ ｒｅｖｅｒｓｅ ｏｒａｌ ｓｕｂｍｕｃｏｕｓ ｆｉｂｒｏｓｉｓ． Ｊ Ｏｒａｌ Ｐａｔｈｏｌ Ｍｅｄ． ２００１，３０（１）：１２－２１．