波罗蜜属药用植物化合物对SMMC-7721、SGC-7901细胞增殖及Caspase-3酶活性的影响
作者：朱国福，杨延龙，侯爱君，张慧卿，李秋爽，张聪聪
【摘要】 目的 研究单体化合物波罗蜜属药用植物化合物（ACR-2、ACR-3）对人肝癌细胞（SMMC-7721）、胃腺癌细胞（SGC-7901）的增殖抑制作用及其Caspase-3酶活性的影响，为进一步研究化合物ACR-2、ACR-3的抗癌机理奠定基础。方法 在±Z-VAD-FMK条件下，分别将不同浓度的ACR-2、ACR-3作用于SMMC-7721、SGC-7901细胞，用Alamar blue法研究ACR-2、ACR-3对SMMC-7721、SGC-7901细胞的增殖及Caspase-3酶活性的影响。结果 在±Z-VAD-FMK条件下，ACR-2作用于细胞SMMC-7721的IC50（mmol/L）分别为0.172±0.128、0.026±0.019，两组比较差异有统计学意义（P<0.05），ACR-3作用于细胞SMMC-7721的IC50（mmol/L）分别为0.141±0.099、0.058±0.047，两组比较差异有统计学意义（P<0.05）；ACR-2作用于细胞SGC-7901的IC50（mmol/L）分别为2.193±0.007、0.058±0.008，两组比较差异有统计学意义（P<0.05），ACR-3作用于细胞SGC-7901的IC50（mmol/L）分别为0.241±0.040、0.021±0.002，两组比较差异有统计学意义（P<0.05）。ACR-2、ACR-3均能激活SMMC-7721、SGC-7901细胞Caspase-3的活性，与阴性对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论 化合物ACR-2、ACR-3对人肝癌细胞SMMC-7721、胃腺癌细胞SGC-7901具有显著的增殖抑制作用，且该作用能被±Z-VAD-FMK所阻断，推测ACR-2、ACR-3抑制SMMC-7721、SGC-7901细胞增殖与其激活Caspase-3的活性密切相关。
【关键词】 波罗蜜属药用植物；单体化合物；抗肿瘤；Caspase-3酶
〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ To investigate the inhibitory effects of ACR-2 and ACR-3 on SMMC-7721 and SGC-7901 cell lines and on enzyme activity of Caspase-3, and provide the basis for the further study of ACR-2 and ACR-3 in anticancer. Methods Under the condition of ±Z-VAD-FMK, the inhibitory effects of ACR-2 and ACR-3 with different concentrations on SMMC-7721 and SGC-7901 cell lines were measured with the micro culture Alamar blue assay, and on the enzyme activity of Caspase-3. Results Under the condition of ±Z-VAD-FMK, IC50（mmol/L）of ACR-2 on SMMC-7721 cell line are 0.172±0.128 and 0.026±0.019（P<0.05）; 波罗蜜属(Moraceae)植物在桑科占有重要地位，全世界有50多种，我国约有15种。原产印度东部，现在热带地区如泰国、越南、菲律宾等国家多有裁培，我国的海南、广东、广西、云南等地也有栽培。其中野树波罗、短绢毛波罗蜜和胭脂在云南西双版纳有较丰富的资源[1，2]。药理研究发现，从该属植物中提取的部分化合物具有细胞毒作用，如从Artocarpus elasticus中分离到的异戊烯基黄酮类化合物对乳腺癌MCF-7、肾癌TK和恶性黑色素瘤UACC-62均有不同程度的增殖抑制作用[3]。本文在±Z-VAD-FMK条件下，采用Alamar blue法，对从波罗蜜属药用植物中分离得到的化合物ACR-2、ACR-3作用于人肝癌细胞SMMC-7721、胃腺癌细胞SGC-7901的增殖抑制作用进行了比较研究，并用分光光度法对其Caspase-3酶活性进行了检测，为进一步研究其抗癌作用机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞株 肝癌细胞SMMC-7721、胃腺癌细胞SGC-7901引自中国院上海生命科学院细胞库。
1.1.2 试剂及配制 磷酸盐缓冲溶液(PBS)：NaCl 8.0 g、KCl 0.2 g、NaH2PO4·12H2O 2.8 g、KH2PO4 0.2 g分别溶解于1 000 mL双蒸水中，121 ℃高压灭菌20 min，保存于4 ℃冰箱，备用。0.25%胰蛋白酶：1∶250胰蛋白酶，为Amresco公司产品，上海华美生物工程公司进口分装。称取胰蛋白酶0.25 g，溶于100 mL PBS中，用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，分装，保存于4 ℃冰箱，备用。RPMI-1640培养液：RPMI-1640培养干粉，为美国GIBCO公司产品，购于北京鼎国生物技术有限责任公司。取RPMI-1640培养干粉1袋，用超纯水溶解，加入NaHCO3 2.0 g、L-谷氨酰胺0.3 g、青霉素钠10万u，链霉素10万u，加超纯水至1 000 mL，用0.1 mol的HCl和Na2OH调整pH7.2~7.3，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，分装，保存于4 ℃冰箱，备用。新生牛血清(NCS)：为Hyclone公司产品，购于上海普飞生物技术有限公司。Alamar blue：为Biosource公司产品，购于晶美生物工程有限公司。苄氧羰-缬氨酰-丙氨酰-天冬氨酰-[O-甲酰]-氟甲基酮(Z-Val-Ala-Asp(OMe)-Fluoromethylketone，±Z-VAD-FMK)：为Alexis公司产品，购于上海晶美生物工程有限公司。Caspase-3/CPP32检测试剂盒：为biovision公司产品，购于上海晶美生物工程有限公司。NaCl、KCl、NaH2PO4·12H2O、KH2PO4二甲亚砜(DMSO)等：均为国药集团产品，分析纯。
1.1.3 仪器设备 CO2细胞培养箱：德国Heraeus公司产品；双人超净工作台：Tsao Hsin公司产品；倒置相差显微镜：日本OLYMPUS公司产品；Biotech酶联免疫检测仪：美国Beckman公司产品；JA1203N型天平：上海精密科学仪器有限公司产品；Milli-Q纯水机：上海和杰科技有限公司产品。BCD-252型依莱克斯常温冰箱：依莱克斯(中国)有限公司产品；Haier立式冷藏柜：青岛海尔电冰柜有限公司产品。
1.1.4 药物及配制方法 波罗蜜属药用植物单体化合物ACR-2、ACR-3由复旦大学药学院分离、鉴定。其中ACR-2(环桂木黄素，cycloartocarpin A)为淡黄色粉末，分子式C28H30O6，分子量434。ACR-3(桂木黄酮，artocarpin)为淡黄色粉末，分子式C26H28O6，分子量436。化合物用DMSO助溶，PBS稀释，配制成一定浓度的母液保存，用时再用PBS或培养液稀释至所需浓度，DMSO终浓度小于0.1%。注射用顺氯氨铂(DDP)，国药准字H37021358，规格20 mg，为齐鲁制药厂产品，购于上海中医药大学附属曙光，批号：0404012。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养[4] 细胞SMMC-7721、SGC-7901用含10％ NCS的无酚红RPMI-1640培养液，在37 ℃、5% CO2和一定湿度条件下常规培养，隔天换液，细胞长满单层后用0.25％胰蛋白酶消化液消化传代。
1.2.2 在±Z-VAD-FMK条件下，ACR-2、ACR-3对细胞SMMC-7721、SGC-7901增殖的影响[5] 细胞SMMC-7721、SGC-7901长满单层后，用0.25%胰蛋白酶消化，加入含10％ NCS的RPMI-1640培养液，用滴管吹打制成单细胞悬液；计数并调整细胞浓度为5×104cells/mL，接种于96孔板，180 μL/well。同时设阴性对照，抑制剂对照，空白对照(只加培养液，不加细胞和药物)；置于37 ℃、5% CO2、一定湿度培养箱中继续培养23 h。抑制剂对照组加入泛Caspase抑制剂±Z-VAD-FMK，终浓度为20 μmol/L,继续培养1 h。试验组和抑制剂对照组分别加入ACR-2、ACR-3使用液20 μL，阴性对照和空白对照组均加入20 μL PBS，继续培养48 h。各孔均加入20 μL Alamar blue，继续培养4 h。用酶标检测仪在570 nm、600 nm波长处检测各孔OD值。所得数值用以下公式各化合物对SMMC-7721、SGC-7901细胞的抑制率：
%IN=[117 216x(T570)-80 586x(T600)/117 216x(C570)-80 586x(C600)]×100％
1.2.3 Caspase-3酶活性检测[6] 细胞SMMC-7721、SGC-7901长满单层后，用0.25%胰蛋白酶消化，加入含10％ NCS的RPMI-1640培养液，用滴管吹打制成单细胞悬液；计数并调整细胞浓度为5×104cells/mL。接种于6孔板，2 mL/well，并设阴性对照组，37 ℃、5% CO2、一定湿度培养箱中培养24 h。试验组加入ACR-2、ACR-3使用液200 μL，阴性对照组加入200 μL PBS，继续培养6、12、24、48 h。吸取培养上清液，备用。用胰蛋白酶消化液消化贴壁细胞，并收集至备用的细胞培养上清液中。离心2 000 r/min，5 min，4 ℃。小心吸除上清，PBS洗涤1次。同前吸尽上清后，按照每200万细胞加入100 μL裂解液的比例加入裂解液，重悬沉淀，计数并调整浓度为5×106cells/mL。置于冰上裂解细胞15 min。离心140 000 r/min，15 min，4 ℃。将上清液转移到预冷的离心管中，置于冰上。立即检测Caspase-3酶活性，取出p-硝基酰苯胺(pNA)和适量的催化底物Ac-DEVD-pNA(2mM)，置于冰上备用。如下设置反应体系：样品组[检测缓冲液80 μL、待测样品10 μL、Ac-DEVD-pNA(2 mM) 10 μL]，空白对照组[检测缓冲液90 μL、Ac-DEVD-pNA(2 mM) 10 μL]，加入Ac-DEVD-pNA(2mM)后混匀，37 ℃孵育2 h。用酶标检测仪检测405 nm处OD值（A405）。样品的A405扣除空白对照的A405，即为样品中Caspase-3催化pNA产生的吸光度。
1.2.4 统计学分析 各组数据均输入计算机，用SPSS12.0统计软件进行t检验和单因素方差分析。
2 结果
2.1 在±ZVAD-FMK条件下，ACR-2、ACR-3对SMMC-7721、SGC-7901细胞增殖的影响
在±Z-VAD-FMK条件下，ACR-2作用于细胞SMMC-7721的IC50（mmol/L）分别为0.172±0.128、0.026±0.019，两组比较有显著性差异（P<0.05）；ACR-3作用于细胞SMMC-7721的IC50（mmol/L）分别为0.141±0.099、0.058±0.047，两组比较有显著性差异（P<0.05）。ACR-2作用于细胞SGC-7901的IC50（mmol/L）分别为2.193±0.007、0.058±0.008，两组比较有统计学意义（P<0.05）；ACR-3作用于细胞SGC-7901的IC50（mmol/L）分别为0.241±0.040、0.021±0.002，两组比较有显著性差异（P<0.05）。说明化合物ACR-2、ACR-3对人肝癌细胞SMMC-7721、胃腺癌细胞SGC-7901具有增殖抑制作用，且这种抑制作用可被±Z-VAD-FMK所阻断。结果见表1、表2。
2.2 ACR-2、ACR-3对SMMC-7721、SGC-7901细胞Caspase-3酶活性的影响
ACR-2、ACR-3均能激活SMMC-7721、SGC-7901细胞Caspase-3的活性，特别在6 h时其活性最强，与阴性对照组比较有显著性差异（P<0.05）。说明ACR-2、ACR-3抑制SMMC-7721、SGC-7901细胞增殖与其激活Caspase的活性密切相关。结果见表3、表4。
3 讨论
恶性肿瘤严重危害着人类的健康。中医药几千年来在保障人民身体健康，防治疾病方面起着非常重要的作用，中药在抑制、杀伤肿瘤细胞，改善患者症状与体征,以及减轻放化疗不良反应方面发挥着重要作用。且疗效肯定、毒副作用小。因而，从中药中寻找毒副作用小、疗效肯定的抗肿瘤药物成为近年来的研究热点[7]。
波罗蜜味甘微酸，性平，无毒，有生津止渴、解烦、醒酒、益气、助消化之功效[8]。在李时珍的《本草纲目》中记载：“波罗蜜生交趾南方诸国。内肉层叠如橘，食之味至甜美如蜜，甘香微酸，止渴解烦，醒酒益气，令人悦泽。核中仁，补中益气，令人不饥轻健。”药理研究发现，从该属植物中提取的部分化合物具有细胞毒作用[9]。我们前期在国家基金（编号：30572247）资助下共分离了23个单体化合物，研究发现其中ACR-2、ACR-3对SMMC-7721、SGC-7901细胞具有显著的增殖抑制作用。
苄氧羰-缬氨酰-丙氨酰-天冬氨酰-[O-甲酰]-氟甲基酮(Z-Val-Ala-Asp(OMe)-Fluoromethylketone,±Z-VAD-FMK)是一种细胞可通透性泛Caspase抑制剂，不可逆地结合在Caspase蛋白酶的催化位点，可以抑制由Caspase激活导致的细胞凋亡[10，11]。常用于观察特定的细胞凋亡是否通过Caspase激活来介导。我们在同时±Z-VAD-FMK的条件下，研究ACR-2、ACR-3对SMMC-7721、SGC-7901细胞的增殖抑制作用。结果发现：在±Z-VAD-FMK不存在的条件下，ACR-2、ACR-3对SMMC-7721、SGC-7901细胞有较强的增殖抑制作用；在±Z-VAD-FMK存在的条件下，ACR-2、ACR-3对SMMC-7721、SGC-7901细胞的增殖抑制作用被阻断（详见表1-2）。
Caspase是一组存在于胞质溶胶中的结构上相关的蛋白酶，在细胞凋亡过程中起着非常重要的作用。研究表明，哺乳动物中最主要的凋亡效应因子是Caspase[12]。其中Caspase-3属于Caspase家族的CED-3亚家族，是细胞凋亡过程中的一个关键酶，也是目前研究最多的一个Caspase。本实验通过检测Caspase-3活性发现：ACR-2、ACR-3均能激活SMMC-7721、SGC-7901细胞Caspase-3的活性，与阴性对照组比较有显著性差异（P<0.05），提示ACR-2、ACR-3抑制SMMC-7721、SGC-7901细胞增殖与其激活Caspase的活性密切相关。
综上所述，化合物ACR-2、ACR-3对人肝癌细胞SMMC-7721、胃腺癌细胞SGC-7901具有增殖抑制作用，且这种作用能被±Z-VAD-FMK所阻断；ACR-2、ACR-3抑制SMMC-7721、SGC-7901细胞增殖与其激活Caspase的活性密切相关。从而推断ACR-2、ACR-3抑制SMMC-7721、SGC-7901细胞增殖可能与通过激活Caspase-3从而引起细胞发生凋亡有关。
【】
[1] 人文出版社委员会.植物大辞典[M].台北:人文出版社印行，1985：1 722-1 723.
[2] 院中国植物志编辑委员会.中国植物志[M].北京:科学出版社,1998:23(1):42.
[3] Boonlaksiri C, Oonanant W, Kongsaeree P, et al. An antimalarial Stilbene from Artocarpus integer[J]. Phytochemistry,2000,54(4):415-417.
[4] 司徒镇强,吴军正.细胞培养[M].西安:世界图书出版公司,2004:189-201.
[5] Luthra S, Fardin B, Dong J, et al. Activation of caspase-8 and caspase-12 pathways by 7-ketocholesterol in human retinal pigment epithelial cells[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2006,47(12): 5569-5575.
[6] Grb S， Persohn E, Trommer WE, et al. Mechanisms of cyclosporine A-induced apoptosis in rat hepatocyte primary cultures[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2000,163(3):209-220.
[7] 朱秀美,刘 屏.国内中药防治化疗药物毒副作用的研究概况[J].解放军药学学报,2001,17(6)：321-323.
[8] 江苏新医学院. 中药大辞典[M].上海:上海科学技术出版社,1977:1 713.
[9] Boonlaksiri C, Oonanant W, Kongsaeree P, et al. An antimalarial Stilbene from Artocarpus integer[J]. Phytochemistry，2000，54(4):415-417.
[10] Harper N, Farrow SN, Kaptein A, et al. Modulation of tumor necrosis factor apoptosis-inducing ligand- induced NF-kappa B activation by inhibition of apical caspases[J]. J Biol Chem,2001,276(37):34 743-34 752.
[11] Naoyuki Okita, Yuki Kudo, Sei-ichi Tanuma. Checkpoint kinase 1 is cleaved in a caspase-dependent pathway during genotoxic stress-induced apoptosis[J]. Biol Pharm Bull, 2007，30(2):359-62.
[12] 李小明,宋天保.“杀手”蛋白酶Caspase[J].细胞生物学杂志，2000，22(2):58-63.
