草分支杆菌F.U.36联合去甲斑蝥素片和中药与HbeAg血清转换的关系
作者：韩祖良 孙渝生 李欣其
关键词：乙肝病毒携带者 侧重 免疫压力 野生型HBV突变成为前C区变异株 HBeAg血清转换
论文摘要：目的 通过草分枝杆菌F.U.36，去甲斑蝥素片和中药联合应用的方式，探索解决乙肝病毒携带者HBeAg血清转换的治疗问题；方法：将205例HBeAg阳性的乙肝病毒携带者随机分成1个治疗组和4个对照组，从不同治疗角度，比对HBeAg血清转换疗效，疗程6个月，追踪观察6个月；结果：治疗组和C组分别有26.66%和17.94%的病例获取了HbeAg血清转换的疗效，而另外3个对照组无一例呈现有HbeAg血清转换疗效的病例，比对研究显示：侧重免疫治疗的治疗组与C组HbeAg的血清转换率无明显差异P>0.05，侧重免疫治疗的治疗方法与侧重抗HBV治疗的治疗方法HbeAg血清转换率存在有非常显著的差异P＜0.01，HBV-DNA载量＜105 copies/ml与HBV-DNA载量>105copies/ml的HbeAg血清转换率存在有非常显著的差异P＜0.01；结论：草分枝杆菌F.U.36联合去甲斑蝥素片和中药联合应用，呈现HBeAg血清转换的疗效，与野生型HBV突变成为前C区变异株的途径有关。
乙肝病毒携带者（AsC）抗HBV治疗不能获取HBV-DNA转阴疗效的原因，公认与乙肝病毒（HBV）感染诱导产生的特异性免疫耐受，以及抗HBV治疗不能恢复特异性免疫应答反应能力的作用有关【1】。但是AsC抗HBV治疗不能获得HBeAg血清转换的疗效，而HBeAg的存在又是AsC的HBV-DNA难以被清除及HBV-DNA又以高载量形式存在的重要原因【2】，所以AsC抗HBV治疗及疗效与特异性免疫耐受的关系，实际反映的是与HBeAg及其诱导产生的特异性免疫耐受的关系，但是这种关系又由于HBeAg阴性的AsC易获得HBV-DNA转阴疗效【3】，以及HBeAg存在有呈现血清转换的临床表现，所以在表达了HBeAg对AsC抗HBV治疗仅呈现为影响HBV-DNA转阴疗效作用的同时，也指出了HBeAg存在有其“正常”血清转换的通道或途径。依此我们从侧重非特异性免疫应答反应的治疗角度，应用草分枝杆菌F.U.36联合去甲斑蝥素片与中药的治疗方式，模拟野生型HBV突变成为C区变异株的方式【4】，对HBeAg血清转换的疗效进行了临床实践的观察研究，现将初步研究结果简要介绍如下；
材料与方法
一、临床资料
205例AsC为2004年10月-2005年5月本院的门诊患者，其中男性121例，女性84例，年龄最大的为47岁，最小为15岁，平均年龄为27.4岁。血中HbsAg阳性持续时间均超过6个月，HBeAg全部为阳性，HBV-DNA的均数为107.2±0.59，其中最高为108 copies/ml ，最低为103copies/ml。有12例ALT轻度升高的病例，ALT平均为47 U/L，最高者为50U/L。全部病例半年内未进行过抗HBV治疗或免疫治疗，治疗前未并发有其它感染性疾病。
二、观察内容及项目
1、采用FQ-PCR法检测HBV-DNA拷贝数试剂盒及操作由中山大学达安基因诊断中心提供及协办，正常标准为<1000copies/ml。
2、应用ELISA法测定HbsAg、抗-HBs、HbeAg、抗-Hbe、抗-HBc，试剂盒由上海科华公司提供，以阳性或阴性表示结果。
3、采用日本CL-8000全自动生化分析仪测定谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、总胆红素（TB）等，试剂盒由上海科华公司提供，正常的标准；ALT；0-40U/L，AST；0-40U/L，TB；5.1-21umol/L。
三、治疗方法
1、治疗组
草分枝杆菌F.U.36（成都金星健康药业有限公司提供）1.72mg肌肉注射，隔日1次；去甲斑蝥素片（厦门建发制药有限公司提供）口服15mg，3次/日；1号中药协定处方（本院配制）煎服，2次/日；疗效6个月
2、对照组
A组：草分枝杆菌F.U.36 1.72mg肌肉注射，隔日1次；拉米夫定（葛兰素史克公司提供）100mg 口服 1次/日；1号中药协定处方 煎服 2次/日，疗程6个月。
B组：拉米夫定 100 mg 口服 1次/日；1号中药协定处方 煎服 2次/日，疗程6个月
C组：草分枝杆菌F.U.361.72mg肌肉注射，隔日1次；1号中药协定处方煎服，2次/日；疗程6个月
D组：去甲斑蝥素片 口服15mg，3次/日；1号中药协定处方 煎服，2次/日；疗效6个月
四、疗效判定标准
有效：HBeAg血清转换
无效：HBeAg仍为阳性
五、统计学处理
数据用X±S表示，率的比较用采用X2检验。
结果
1、不同药物及治疗方式与HBeAg血清转换率的关系：
从药物单独与联合应用，侧重免疫治疗（治疗组和C组）与侧重抗HBV治疗（A组，B组，以及D组）的治疗角度，比对不同治疗方法与HBeAg血清转换的疗效关系，结果（见表1）治疗3个月后侧重免疫治疗的治疗组有15.5%的病例出现HBeAg血清转换的疗效，C组有12.82%的病例呈现有HBeAg血清转换的疗效，而侧重抗HBV治疗的A组，B组，以及D组无一例出现有HBeAg血清转换的疗效，显示侧重免疫治疗的治疗方法HBeAg血清转换率显著地高于侧重抗HBV治疗的治疗方法；P＜0.01，说明HBeAg血清转换与非特异性免疫激活药物的选择应用有关，而侧重免疫治疗的治疗组和C组虽然两者HBeAg血清转换率无明显的差异；P＞0.05，但是联合应用与单独应用均呈现有HBeAg血清转换的疗效，进一步表明了HBeAg血清转换与非特异性免疫应答反应的作用的结果有关。但是值得注意的是治疗组与A组因选择应用了不同的抗HBV药物而呈现HBeAg血清转换率的显著差异，P＜0.01，显示药物联合应用尚存在有相互影响而呈现的干扰作用，也是影响HBeAg血清转换疗效的重要因素。
表1；3个月后不同治疗方法呈现HBeAg血清转换的疗效
例数 HBeAg血清转换数 （%） HBeAg转阴数 （%）
治疗组 45 7/45 15.5 2/45 4.44
对照组 A组 42 0/42 0.00 0/42 0.00
B组 40 0/40 0.00 0/40 0.00
C组 39 5/39 12.82 1/39 2.56
D组 39 0/39 0.00 1/39 2.56
2、治疗方法持续应用与HBeAg血清转换率的关系
表2随着治疗方法的持续应用侧重免疫治疗的治疗组HBeAg血清转换率由3个月时的15.5%升高至疗程结束时的26.66%，C组HBeAg血清转换率由3个月时的12.82%微升至疗程结束时的17.94%，而侧重抗HBV治疗的3个对照组并未随着治疗方法的持续应用而出现有HBeAg血清转换的疗效。显示侧重免疫治疗的治疗组和C组HBeAg血清转换率与治疗方法的持续应用呈正比关系，而侧重抗HBV治疗的A组，B组，以及D组HBeAg血清转换率与治疗方法的持续应用无明显关系，进而表明侧重免疫治疗的治疗方法能够呈现HBeAg血清转换率逐增的原因，与非特异性免疫激活药物的免疫刺激作用促使非特异性免疫应答反应的状态呈现动态变化的结果有关，而抗HBV治疗不伴随有非特异性免疫应答反应状态的动态变化，非特异性免疫应答反应依然处在低下的状态，是持续抗HBV治疗仍然不能获取HBeAg血清转换疗效的原因所在。
表2；疗程结束后不同治疗方法呈现HBeAg血清转换率
例数 HBeAg血清转换 （%） HBeAg转阴 （%）
治疗组 45 12/45 26。66. 3/45 6.66
对照组 A组 42 0/42 0.00 0/42 0.00
B组 40 0/40 0.00 0/40 0.00
C组 39 7/39 17.94 2/39 5.12
D组 39 0/39 0.00 0/39 0.00
3、HBV-DNA载量与HBeAg血清转换率的关系
侧重免疫的治疗组和C组中有30例HBV-DNA载量≤105 copies/ml的HBeAg阳性的AsC，其中的19例（62.06%）呈现HBeAg血清转换的疗效，但同样的治疗方法并未能使54例HBV-DNA载量＞105 copies/ml的HBeAg阳性的AsC呈现有HBeAg血清转换的疗效，而侧重抗HBV治疗的A组，B组，以及D组对HBeAg阳性的AsC虽然均未呈现有HBeAg血清转换的疗效，但是无疗效的结果与HBV-DNA载量无明显的关系，显示HBeAg血清转换的疗效虽然与侧重免疫治疗的治疗方法的选择应用有关，但是疗效与HBV-DNA载量又存在有显著相关性，所以HBV-DNA与非特异性免疫应答反应存在的相互制约关系，是影响HBeAg血清转换的最为重要的影响因素。
表3；比较HBV-DNA载量与HBeAg血清转换的关系
例数 HBV-DNA载量＞106 HBeAg血清转换数 HBV-DNA载量≤105 HBeAg血清转换数
治疗组 45 37/45 0/45 18/45 12/45
对照组A组 42 32/42 0/42 10/42 0/42
B组 40 29/40 0/40 11/40 0/40
C组 39 27/39 0/39 12/39 7/39
D组 39 30/39 0/39 9/39 0/39
4、HBeAg血清转换与肝功能的关系:
治疗前有12例ALT轻度升高的病例，平均为47 U/L，最高者为50U/L，其中治疗组有2例HBV-DNA载量≤105 copies/ml，ALT为44 U/L和49 U/L的病例，随着HBeAg血清转换ALT均恢复至正常水平状态，余它的10例ALT轻度升高的病例分布于各组中，疗程结束后ALT仍处在轻度升高的状态，全部的治疗方法无论是否呈现HBeAg血清转换均未呈现有ALT升高的新增病例，ALT也未呈现有在原有基础上出现增高的情况。
讨论
HBeAg阳性的AsC抗HBV治疗不能获得HBV-DNA转阴疗效的原因，我们所获得的研究结果与大多认为主要与特异性免疫耐受有直接关系的结果并不完全相一致，这是因为我们发现：（1）HBeAg阳性的AsC 是由HBV-DNA，非特异性免疫应答反应能力低下，HBeAg，以及特异性免疫耐受4个“相关因素”所构成；（2）抗HBV药物与非特异性免疫激活药物同步联合应用可以使绝大多数HBeAg阴性的AsC短时间内获得HBV-DNA转阴的疗效，而同样的治疗方法在相同的治疗时间内仅能使HBeAg阳性的AsC由高载量的HBV-DNA获得下降幅度>2log10的有效结果；（3） HBeAg阳性的AsC抗HBV治疗的有效结果并不出现HBeAg血清转换的疗效，持续抗HBV治疗因HBeAg的存在而HBV-DNA又呈现从有效到反弹的后果等。所以我们以为HBeAg阳性的AsC抗HBV治疗不能获得HBV-DNA转阴疗效的原因，与上述4个相关因素共存所呈现的相关作用有关，其中由于HBeAg阳性的AsC抗HBV治疗获取HBV-DNA转阴疗效与HBeAg获得血清转换的疗效有直接的关系，所以特异性免疫耐受与HBeAg阳性的AsC的关系，实际反映的是HBeAg及其诱导产生的特异性免疫耐受与HBeAg阳性的AsC的关系，而HBeAg及其诱导产生的特异性免疫耐受与HBeAg阳性的AsC抗HBV治疗及疗效的关系，又由于HBeAg发生血清转换后HBV-DNA易获得转阴的疗效，所以HBeAg及其诱导产生的特异性免疫耐受对HBV-DNA转阴仅呈现为“影响”疗效作用，然而尽管这种“影响”作用所呈现的后果与认为与特异性免疫耐受有关的结果相一致，均因免疫耐受而导致HBeAg阳性的AsC抗HBV治疗不能获得HBV-DNA转阴的疗效，但是不同之处在于我们的研究结果表明HBeAg阳性的AsC抗HBV治疗的疗效仅与HBeAg及其诱导产生的特异性免疫耐受有关，而有关的结果又显示两者并不存在有疗效的“因果”关系，这样解决HBeAg血清转换的治疗问题，除了特异性免疫疗法和HBeAg耗竭疗法外，野生型HBV突变成为前C区变异株，终止HBeAg的生成机制【5】，可能是HBeAg呈现血清转换最为重要的途径。为此我们依据野生型HBV突变成为前C区变异株与免疫压力作用有关的报道【6】，选择应用非特异性免疫激活药物，即草分枝杆菌F.U.36联合去甲斑蝥素片和中药的治疗方式，从以提高或改善非特异性免疫应答反应能力或状态为主的治疗角度对HBeAg阳性的AsC进行了HBeAg血清转换疗效的观察研究，结果与对照组相比治疗组呈现有如下的一些与疗效有关的机制：
（1）侧重免疫治疗的治疗方法与侧重抗HBV治疗的治疗方法呈现对HBeAg血清转换的反差疗效，说明HBeAg血清转换与非特异性免疫激活药物的选择应用及作用有关，而相关的作用机制，由于非特异性免疫应答反应与特异性免疫耐受并不存在有交叉式的治疗关系，以及HBeAg血清转换后HBV-DNA仍以低载量的形式存在【7】，所以非特异性免疫应答反应促使HBeAg呈现血清转换疗效的作用，显然与诱导野生型HBV突变成为前C区变异株，终止HBeAg生成的作用方式有关。而侧重抗HBV治疗的治疗方法未见有HBeAg血清转换疗效的原因，显然与抗HBV治疗不伴随有非特异性免疫应答反应能力的提高或改善，以及非特异性免疫应答反应仍处在低下状态，不能形成有效的免疫压力作用的结果有关，并且从相反的治疗角度又为HBeAg血清转换与非特异性免疫应答反应的压力作用有关的结果提供了佐证。
（2）侧重免疫治疗的治疗方法对HBV-DNA载量≤105 copies/ml的HBeAg阳性AsC有呈现HBeAg血清转换的疗效，而同样的治疗方法对HBV-DNA载量＞105 copies/ml，以及侧重抗HBV治疗的治疗方法对不同HBV-DNA载量的HBeAg阳性的AsC均无呈现有HBeAg血清转换的疗效结果，不仅进一步证明了HBeAg血清转换与非特异性免疫应答反应的作用结果有关，而且更为重要的是比对研究发现了HBV-DNA与非特异性免疫应答反应存在的相互制约关系，对HBeAg血清转换所呈现的影响作用，侧重抗HBV治疗的治疗方法不能解决HBeAg血清转换的疗效问题，与HBV-DNA载量无关，而与非特异性免疫应答反应低下的结果有关，以及侧重免疫治疗的治疗方法能够解决HBeAg血清转换的疗效问题，与HBV-DNA载量和非特异性免疫应答反应能力的状态有关的结果等，表达了以降低并保持HBV-DNA处在低载量的状态为基础，应用侧重免疫治疗的治疗方式，是促使HBeAg实现血清转换疗效的两大基本要素及条件。
（3）草分枝杆菌F.U.36联合应用去甲斑蝥素片和中药与草分枝杆菌F.U.36和中药，尽管两者呈现HBeAg血清的转换率无明显差异，并且同样也存在有不能使HBV-DNA＞105 copies/ml的HBeAg阳性的AsC获得HBeAg血清转换的疗效“缺陷”问题，但是由于HBeAg血清转换与非特异性免疫应答反应的压力作用显著相关，而HBV-DNA和多种因素可以影响或改变非特异性免疫应答反应的状态，所以草分枝杆菌F.U.36联合应用去甲斑蝥素片，在稳定HBV-DNA处在低载量的状态，防范HBV-DNA反弹，更有效的发挥草分枝杆菌F.U.36的免疫激活作用，以及提高HBeAg血清转换率等方面明显的优于草分枝杆菌F.U.36单独应用。
（4）草分枝杆菌F.U.36联合应用去甲斑蝥素片和中药有促使HBeAg呈现血清转换的疗效作用，而草分枝杆菌F.U.36联合应用拉米夫定和中药则无一例呈现有HBeAg血清转换的疗效，这个因选择应用不同的抗HBV药物而呈现HBeAg血清转换的疗效差异，其原因尽管并不十分清楚，但是去甲斑蝥素片与草分枝杆菌F.U.36和中药联合应用，能够获取HBeAg血清转换疗效的原因，与去甲斑蝥素片抗HBV作用弱及不影响免疫应答反应的药理特性，治疗方法突出以免疫作用为主，以及强化草分枝杆菌F.U.36的免疫压力作用的结果有关。反向的证明了联合应用拉米夫定不能获取HBeAg呈现血清转换的原因，与拉米夫定可能存在对非特异性免疫应答反应的影响作用，或与其抑制HBV作用的强度大于草分枝杆菌F.U.36免疫刺激的作用的能力而产生的干扰作用，以及治疗方法呈现的是以抗HBV治疗的作用为主等的问题有关。
依据上述所呈现的相关机制我们将HBeAg血清转换的治疗过程简要的概括为；对于HBV-DNA载量≤105copies/ml的HBeAg阳性的AsC，应用草分枝杆菌F.U.36，去甲斑蝥素片和中药联合应用的治疗方式，通过去甲斑蝥素片抑制HBV复制，防范HBV-DNA反弹，保持HBV-DNA始终处在低载量状态的结果为基本点，致使非特异性免疫应答反应的反制约作用的能力大于HBV-DNA对其的制约作用，再利用并强化草分枝杆菌F.U.36的免疫刺激的压力作用，通过野生型HBV突变成为前C区变异株的途径，终止HBeAg生成并实现HBeAg血清转换的疗效目的。
然而尽管草分枝杆菌F.U.36联合去甲斑蝥素片和中药，可以获取HBeAg血清转换的疗效，治疗过程也未出现有ALT升高及肝功能受损和其它的不良反应，16例呈现HBeAg血清转换的病例追踪观察6个月，无一例出现HBeAg阳转的表现，但是本研究中存在的最大问题是；（1）由于HBeAg阳性AsC的HBV-DNA载量大多＞105 copies/ml，而草分枝杆菌F.U.36无论是单独应用还是与去甲斑蝥素片联合应用均不能解决HBV-DNA＞105 copies/ml的HBeAg阳性的AsC的HBeAg血清转换的治疗问题，所以提高HBeAg阳性AsC的HBeAg血清转换率，尚需要进一步研究解决抗HBV治疗降低HBV-DNA水平状态与HBeAg血清转换的疗效衔接问题；（2）去甲斑蝥素片具有抗HBV作用而不影响免疫应答反应的药理特性，虽然与HBeAg血清转换的机制相吻合，但是由于其仅对低载量的HBV-DNA有一定的抑制作用，以及无提高或改善非特异性免疫应答反应能力的作用，所以治疗过程中常因干扰因素的影响而呈现HBV-DNA反弹的后果，所以进一步研究及寻找即有显著抑制HBV复制，又不影响免疫应答反应，以及药物联合应用具有提高HBeAg血清转换疗效的抗HBV药物仍是今后的研究重点；（3）HBeAg血清转换的途径，虽然各方面的迹象表明，与野生型HBV突变成为前C区变异株的结果有关，但是由于受条件等的限制，未将前C区变异株的检测设为观察指标，有待今后补充解决。
【1】高寿征。病毒性肝炎防治研究 第一版,北京出版社，1993,5;221
【2】韩祖良等，乙肝病毒携带与非特异性免疫应答机制的关系，美中医学，2007.6:32-39
【3】韩祖良等，拉米夫定单独及联合应用与HBV-DNA疗效的关系，科技在线.2008.11
【4】姚桢，分子乙型肝炎病毒相关病学 第一版，北京，中国医药科技出版社，1998.1:26
【5】姚桢，分子乙型肝炎病毒相关病学 第一版，北京，中国医药科技出版社，1998.1:60
【6】姚桢，分子乙型肝炎病毒相关病学 第一版，北京，中国医药科技出版社，1998.1;105
【7】韩祖良等，乙肝病毒携带者的转归与治疗方案和治疗方式的关系，中国科技论文在线.2008.10
