赤芍水提物对肝星状细胞株 HSC-T6促凋亡作用的实验研究
作者：韩海啸 李军祥 刘大新 朱陵群 崔巍
【摘要】 目的应用流式细胞法，研究灌服赤芍水提物后的犬血清对乙醛造模后的肝星状细胞株 HSC-T6细胞的促凋亡作用。方法采用乙醛造模后的肝星状细胞株 HSC-T6 作为体外研究模型，以赤芍水提物给彼格犬一次性灌胃，取给药前的血清、给药后 1 h、2 h、3 h、5 h 血清作为实验药物血清。以流式细胞法（flow cytometry）分别检测以上采血时间点上 2% 浓度的药物血清对乙醛造模后的肝星状细胞株 HSC-T6 作用 72 h 后的促凋亡作用。结果 2 h、3 h 两个时间点的含药血清能明显促进 HSC-T6 细胞的凋亡，其中 2 h 2% 含药血清的促凋亡率 5.71%，3 h 2% 含药血清的促凋亡率 5.73%。和同样条件下用空白血清培养的 HSC-T6 细胞相比其凋亡 比例显著性增加（均为 P < 0.05）。在药物血清的作用下两个时点组的 HSC-T6 细胞在 G0/G1 期细胞比例明显上升（P < 0.05）；而 S 期细胞显著减少（P < 0.05）；但 G2/M 期并没有一致性的变化。结论 两个时点的药物血清对 HSC-T6 细胞都有显著的促凋亡作用，且能显著增加 HSC-T6 细胞在 G0/G1 期的比例及显著降低 S 期的比例，这可能是其抑制 HSC-T6 细胞增殖及促凋亡的原因之一。
【关键词】 赤芍水提物；肝星状细胞株 HSC-T6；凋亡； 酒精性肝纤维化；细胞培养；流式细胞术
〔Abstract〕 Objective By means of flow cytometry, we studied the apoptosis-promoting effects of the dog serum fed by Chishao distilled substances on hepatic stellate cell (HSC-T6) builded model by acetaldehyde. Methods The experiments adopted eternalized human hepver Fibrosis; Cell Culture; Flow Cytometrystellate cell (HSC-T6) builded model by acetaldehyde, for study in vitro. Feeding the dog with Chishao distilled substances one time, we took the serum before feeding and at 1-hour、2-hour、 3-hour and 5-hour different points of time, when the medicated serums had been proved best inhibiting effects, after feeding as the medicated serum for experiment. By means of flow cytometry, we examined the apoptosis-promoting effects in 72 hours on HSC-T6 cells by 2% concentration of medicated serum at different points of time. Results The medicated serums has significant effects of promoting HSC-T6 apoptosis at these two points of time. Compared with non-medicated serums under the same conditions, the proportion of apoptosis had a significant increase (P < 0.05). At the 2-hour, 3-hour point, the apoptosis rate of it is 5.71%、5.73%. HSC-T6 cells, proportion was increased in G0/G1 period (P < 0.05) and decreased in the S period (P < 0.05), while no consistant changes are observed in G2/M period. Conclusion At these two points of strongest inhibiting effects, the serums had significant promoting-apoptosis effects on HSC-T6. Dramatically decreasing HSC-T6 cells' proportion in S period and increasing it in the G0/G1 period were probably responsible for the effects of inhibiting the proliferation of HSC-T6 cells and promoting their apoptosis.
〔Key Words〕 Chishao Distilled Substances; Hepatic Stellate Cell (HSC-T6); Apoptosis; Alcoholic Liver Fibrosis; Cell Culture; Flow Cytometry
随着社会的和嗜酒人群的扩大，酒精引起的肝损害巳成为社会问题的重要内容。酒精性肝损害发展到后期易形成酒精性肝纤维化和酒精性肝硬化，其预后不良。目前普遍认为，肝星状细胞（HSC）是肝纤维化的主要效应细胞，肝星状细胞是肝脏产生细胞外基质的主要来源，其大量增殖和凋亡相对不足在肝纤维化的发生中起核心作用，抑制其增殖和（或）诱导其凋亡是抗肝纤维化的重要对策[1]。
近年来研究表明，活血化瘀、益气健脾为主中药赤芍对肝纤维化有很好的作用，显示出良好的开发与应用前景。本实验通过细胞培养方法，选取以乙醛造模后的肝星状细胞株 HSC-T6 为体外模型，以排除复杂的体外因素影响，并从研究灌服赤芍水提取物后的犬血清对肝星状细胞的抑制作用入手，用流式细胞仪技术观察赤芍入血后促肝星状细胞凋亡的最佳作用时间点（段），并进一步研究其促凋亡机理。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 细胞系 肝星状细胞株 HSC-T6 由北京友谊肝病中心馈赠。由 SV40 转染 prague- Dauley 大鼠星状细胞而成，其表型为活化的 HSC，表达高水平的Ⅰ型胶原、TIMP-1 mRNA 等[1]。常规复苏、传代后，在 5% CO2 饱和条件下细胞培养箱内培养待用。
1.1.2 药品和主要试剂 ①赤芍水提物制备：赤芍水煮提取，提取液经 50% 乙醇沉淀后，滤除沉淀，上清液回收溶剂得赤芍水提物。1 mL 水提物中含 3 g 生药，由北京中医药大学东方医院药学部提供。②主要试剂：DMEM/高糖培养基：美国 GIBCO 公司提供；标准胎牛血清（国产，天津川页公司提供）；胰酶：GIBCO 公司提供；乙醛：国产分析纯；6 孔板，96 孔细胞培养板：丹麦 NUNC 公司提供；染色液：PI（碘化丙啶）、RNAse A ：Sigma 分装。
1.1.3 仪器 CO2 培养箱：美国 NAPCO 5410 型；倒置相差显微镜：日本 OLYMPUS IM2 型；DNA 周期及凋亡分析软件：Modit LT；流式细胞分析仪器及软件。
1.2 实验方法
1.2.1 药物血清制备 用赤芍水提物给纯种雄性彼格犬一次性灌胃，剂量为 2 mL/kg（相当于人体用量的 10 倍）。空白血清、给药后 10、30、60 min 及 2 、3、4、5、6、8、10、12、14、16、20、24 h 各时点的血清（采用 1 只雄性彼格犬，于灌胃后使用 1 次性真空抗凝管取血），灭活补体后于 -20℃ 冰箱冷冻备用。
1.2.2 培养基的配制 基本培养基：DMEM（高糖，GIBCO 公司产品）培养基以三蒸水配制，加 2.5 g/L 的 NaHCO3， 2.2 g/L 的 Hepes 0.22 m 微孔滤膜过滤除菌，4℃下保存。完全培养基的配置：90% 基本培养基和 10% 标准胎牛血清（国产，天津川页公司提供），及青、链霉素各 10 万 U/L。
1.2.3 HSC-T6 细胞的培养 细胞以完全培养基培养于 37℃ 5% CO2 的培养箱中。当细胞长到适当密度（80%~90% 融合）后，按 1:3 传代。
1.2.4 实验分组及给药方法 我们在前期的实验中发现，灌服赤芍水提物后 1 h、2 h、3 h、5 h 时间点 2% 浓度的药物犬血清对 HSC-T6 增殖抑制作用强。取对数生长期的 HSC-T6 细胞，使用 0.1% 胰酶和 0.1% 乙二胺四醋酸（ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA）的混合消化液消化，用完全培养基将细胞悬液的浓度调至 2×104 个/mL，接种于 6 孔板，每孔加入细胞悬液 3 mL。于培养箱中培养 24 h 后，更换含药培养基（取对应 2 h，3 h 两个不同时点采集的药物血清）继续培养 72 h ，每板设 1 组常规培养细胞。
1.2.5 检测指标 流式细胞法检测灌服赤芍水提物后提取的犬血清对 HSC-T6 细胞的促凋亡作用使用：消化液消化，离心收集细胞及培养上清，PBS 洗涤 1 次；70% 冷乙醇 4℃ 分散固定过夜；PBS 洗涤 1 次，RNA 酶（20 mg/L）37℃ 消化 30 min；PBS 洗涤 1 次，PI 染液（50 mg/L）4℃ 避光染色 30 min 流式细胞仪分析细胞凋亡及细胞周期情况。
1.2.6 统计学处理 数据采用均数±标准差（x±s）表示，应用 SPSS 11.5 统计软件进行单因素方差分析，P < 0.05 为差异有显著性。
2 实验结果
2.1 倒置相差镜下观察药物血清对 HSC-T6 细胞的增殖抑制作用
倒置相差镜下观察在药物血清作用后的 HSC-T6 细胞，我们发现：正常培养的 HSC-T6 细胞多数呈星形，多边形，胞质丰富，单层铺路石样排列。模型组细胞生长旺盛伸出多个伪足，细胞间突触连接明显，有的融合在一起形成片状，个别细胞突触伸长明显形成超长形态细胞，高倍镜下细胞核呈圆形或不规则形，核仁圆形，清晰可见。在更换 2 h，3 h 2% 含药培养基作用下，HSC-T6 细胞的增殖速度明显减慢，部分细胞逐渐出现胞浆窄缩，细胞由星芒状变为圆形或长圆形，细胞间隙较宽，细胞内出现大量空泡，但少有悬浮细胞甚至脱落。
2.2 流式细胞法检测含药血清促 HSC-T6 细胞凋亡作用及对周期的影响
正常培养及乙醛造模后的 HSC-T6 细胞存在一定比例的凋亡，在含有一定比例含药血清的完全培养基中培养 72 h 后，经流式细胞仪检测发现被挑选出来的两个时间点的含药血清能明显促进 HSC-T6 细胞的凋亡，其凋亡比例显著性增加（P < 0.05），如表 1、图 1、图 2 所示。
和正常组相比，乙醛模型组 G0/G1 期细胞比例明显下降（P < 0.05）；而 G2-M 期、S 期细胞显著增加（P < 0.05），表明乙醛可促进 HSC-T6 的增殖，活化，造模成功；在 2% 空白狗血清作用下 G0/G1 期，S 期，Apop 期的细胞比例较正常组细胞有上升和下降，符合细胞增殖表现，较模型组细胞比例无明显变化；在 2% 药物血清的作用下 2 h，3 h 两个时点组的 HSC-T6 细胞在 G0/G1 期细胞比例较模型组明显上升（P < 0.05），S 期细胞比例较模型组下降明显，同时两个时点组的 HSC-T6 细胞在 Apop 期比例较正常组及模型组都有明显上升（P < 0.05）。
通过比较乙醛造模后的 HSC-T6 细胞、无药血清和药物血清刺激后 HSC-T6 细胞的 DNA 周期分析图谱可以看出：2 h、3 h 药物血清组的 HSC-T6 细胞和模型组比较时发现 G0/G1 期所占比例增高，但 G2-M，S 期下降，这说明药物血清作用后的 HSC-T6 细胞被阻滞于 G0/G1 期抑制其增殖，同时 Apop 期细胞比例增加明显，表明此前细胞凋亡增加。如图 3 所示。
3 讨 论
酒精性肝纤维化表现为在乙醇及其初级代谢产物乙醛的长期作用下，纤维结缔组织增生和降解失去平衡，导致肝脏细胞外基质的异常沉积。目前认为活化肝星状细胞 HSC 在肝纤维化发病机制中发挥关键作用[2]，减少活化 HSC 数量有利于肝纤维化逆转。 Wright 等[3]证实诱导 HSC 凋亡可减轻肝纤维化程度，因此诱导 HSC 凋亡是抗肝纤维化的一种有效途径。Iredale 等[4]研究发现，活化 HSC 数量减少主要通过凋亡途径。
PI 染色法加散射光联合分析方法是流式细胞仪检测凋亡的经典方法。这种方法除了能定量分析凋亡细胞的比例，最大优点是能同时进行细胞周期分析。通过先前实验结果，我们发现 2 h、3 h 时间点2% 药物血清的对模型细胞生长有较好的抑制作用，并选取此时点含药血清对 HSC-T6 细胞进行流式细胞仪检测细胞周期及凋亡的实验，结果发现 HSC-T6 细胞在 2 h、3 h 两个时点 2% 药物血清的作用下 G0/G1 期细胞比例较模型组明显上升（P < 0.05），S 期细胞比例较模型组下降明显，Apop 期比例较正常组、模型组及空白血清组都有明显上升，具有显著的促凋亡作用。细胞凋亡与细胞周期活动是密不可分的，当细胞周期转换过程中的某一环节受阻时，机体可通过细胞周期调控相关基因诱导该细胞凋亡，清除该细胞，从而维持机体正常生理机能和自身稳定[5]。本实验发现赤芍水提物使 HSC-T6 细胞各周期都发生了改变，尤其是其对 G0/G1 期、S 期的影响， HSC-T6 细胞在增殖信号的刺激下，由静止状态（G0 期）进入 G1 期 - S 期 - G2 期 - M 期。细胞进入 G1 期的后期，开始合成 DNA 前体物质，细胞一旦进入此期如无特殊干扰，便能按细胞周期顺序下去，直至重新回到 G1 期为止，如在 G1-S期阻断，便能有效地限滞细胞的增殖[6]。此期，用流式细胞仪测定 HSC-T6 细胞周期，发现模型组细胞 G1 期减少， S 期细胞增加，提示乙醛造模后细胞增殖活跃，予药物血清作用后，G1 期细胞增加，而 S 期细胞减少，说明赤芍水提物药物血清阻滞 HSC 从 G1 期向 S 期的进行，造成 G1 期细胞堆积，阻滞 DNA 合成和复制，起到抑制 HSC 增殖周期的作用。我们认为，很可能正是这种由赤芍水提物药物血清造成的细胞周期转换过程的障碍，在 G0/G1 期峰前出现了亚二倍体的凋亡峰，导致 HSC-T6 细胞增殖抑制和凋亡的发生。
近几年大量研究表明凋亡相关基因 Fas，Bcl-2 和 p53 参与 HSC-T6 凋亡。 Abriss B[7]等在培养活化的 HSC 中加入可表达 p53 的腺病毒，结果 p53 蛋白主要表达于 HSC 的细胞核，其表达明显抑制 HSC 增殖和诱导 HSC 凋亡。研究表明转导 p53 提供了一种在活化 HSC 中诱导凋亡的切实可行的途径。许伟华[8]等，罗云[9]等在研究丹参对原代分离的大鼠 HSC 的作用中也发现，丹参诱导 HSC 凋亡过程中伴随有 Fas 和 Fasl 的表达增多，Bax 增多，Bcl-2 减少，从而认为丹参通过 Fas 途径及增加 Bax 表达和减少 Bcl -2 的表达而诱导肝星状细胞凋亡。
本实验证明赤芍水提物可明显抑制 HSC-T6 增殖和促其调亡，考虑其作用机理可能与药物血清阻止 HSC-T6 通过 G1/S 关卡，干扰其细胞周期的正常进行；下调 Bcl-2/Bax 比率，以增加细胞对凋亡的敏感性，从而促进 HSC-T6 凋亡有关。然而参与细胞周期调控的因子很多,也比较复杂，故下一步实验将进行相关细胞分子学机制研究以明确赤芍水提物影响细胞增殖和凋亡的具体机制。
【】
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