实验性糖尿病大鼠的胃动力基本单位病理损害及中药糖胃康的防治作用
【摘要】 目的 揭示糖尿病胃动力障碍（DGMD）发生的电生理及细胞病基础。方法 清洁级雄性SD大鼠胃窦部埋植银电极，以成都泰盟BL-410型生理实验系统记录胃电。除对照组大鼠外，其余大鼠腹腔注射链脲佐菌素以制作糖尿病模型（DM组），并随机抽取约一半造模大鼠灌服中药复方糖胃康（DM-TCM组）。实验电生理观察2个月后，三组大鼠的胃组织做纵肌-神经丛铺片，并综合应用NDP组化染色、ZIO组化染色、c-kit及nNOS免疫组化法，以光镜及电镜观察DM组大鼠胃动力基本功能单位，即壁内神经（ENS）-Cajal间质细胞（ICC）-平滑肌（SMC）的病理改变，并观察糖胃康的作用。结果 （1）DM组大鼠的胃电明显异常，主要表现为胃电基本电节律的频率、波幅及峰电发生率均低于对照组，其波幅尚随造模时间推移而下降。（2）而DM-TCM组大鼠胃电波幅随造模时间推移的下降则较轻微，其峰电发生率亦高于DM组。（3）DM组大鼠胃动力基本功能单位有明显的病理改变，其SMC排列紊乱，SMC内有较多胞质溶解性空泡，线粒体肿胀；肌间丛ENS神经元胞质部分溶解，线粒体肿胀，嵴溶解，神经轴突有较多空泡性变；ICC分布不均，数量减少，线粒体水肿，核周细胞质减少等。（4）DM-TCM组大鼠胃ENS、ICC及SMC的病理改变明显轻于DM组。结论 上述结果可部分解释DGMD发生及糖胃康防治DGMD的机制。
【关键词】 糖尿病胃动力障碍；壁内神经；Cajal间质细胞；中药
［Abstract］ Objective To reveal the electrophysiological manifestation and cytopathological basis of diabetic gastromotility disorder（DGMD）.Methods Male Sprasue-Dawley rats of clean class（CL） were used for the study.Silver electrodes was embedding in gastric antrum in rats and Chengdu Taimeng BL-410 physiological experimental system was used to recort electrogastric activity. Streptozotocin was injected intraperitoneally to establish diabetic models.Diabetic rats were randomly divided into diabetes model group （DM group） and diabetes model-TCM group（DM-TCM group）.DM-TCM group was treated with traditional Chinese medicine Tangweikang.After 2 months of electrophysiological observation，rats were killed and stomach tissues were examined for ZIO，c-kit and nNOS by immunohistochemistry.Light and electron microscope were used to study the pathological changes of basic functional unit of gastric motility（BFUGM），i.e.enteric nervous system（ENS）-interstitial cells of Cajal（ICC）-smooth muscle（SMC）in rats of DM group and to observe the preventive effect of Tangweikang.Results （1）There were apparent abnormal electrogastric activities in rats of DM group.The frequency and wave amplitude of basic electric rhythm（BER） of electrogastric activity and the incidence of spike potential were lower than those of control rats.The wave amplitude decreased with time in DM model.（2）The decrease of BER amplitude of electrogastric activity in rats of DM-TCM group with time in DM model making was slight and the incidence of the spike potential was also higher than that of DM groups.（3）There were marked pathological changes of BFUGM in rats of DM group，including disorganized arrangements，cytoplasmic dissolving vacuoles and swelling mitochondria in SMC；partial resolution of cytoplasm，swelling mitochondria，lysis crest，and vacuolar changes in neres axon of neuron of the intermuseular nervous plexus；uneven ICC distribution，swelling mitochondria and diminished cytoplasm around the nucleus.（4）The pathological changes of BFUGM in rats of DM-TCM group were apparently less than those of DM group.Conclusion The above results can partially explain the mechanism of DGMD and the prentive effects of Tangweikang.
［Key words］ diabetic gastromotility disorder；enteric nervous system；interstitial cells of Cajal；traditional Chinese medicine complex composition Tangweikang
糖尿病（diabetes mellitus，DM）的危害性很大程度在于其并发症。DM患者在发病较长时间，且未有效控制血糖的情况下，可发生多种并发症。DM的心、脑、肾、眼并发症较严重，且研究较多。近年研究表明，DM胃肠并发症包括胃动力障碍（diabetic gastromotility disorder，DGMD）的发生率颇高，并显著影响患者的健康和生活质量［1］。但目前对DGMD未予足够重视。关于DGMD发生机制亦研究不多。因此，DGMD发生机制及防治研究具有重要的学科建设意义，并极大地有益于人民健康。过去以为胃肠电及动力的发生是肌源性，即由平滑肌本身发动的。近年研究发现，消化道Cajal间质细胞（interstitial cells of Cajal，ICC）具有基本电节律起搏和传播功能，并为胃肠壁内神经（enteric nervous system，ENS）信号向平滑肌细胞（smooth muscle cells，SMC）传送的中介与调节者。较新的观点尚以“ENS运动末梢-肌间丛ICC-SMC”为胃肠动力基本功能单位（basal function unit of GI motility，BFUGIM）。而BFUGM的病理改变和（或）功能异常，则是DGMD发生的关键性局部机制。现报告关于DM模型大鼠DGMD发生的电生理与BFUGM细胞病理学基础及糖胃康作用的研究如下。
1 材料与方法
1.1 实验目的 胃电为诱发胃平滑肌运动所必需，埋藏电极记录的胃电可间接反映胃动力状况。本实验旨在观察DM模型大鼠的胃电异常，研究胃动力基本功能单位BFUGM（ENS-ICC-SMC）的病理改变，并分析这些改变在胃动力障碍发生中的意义。本实验还观察中药复方糖胃康防治DGMD的作用。
1.2 材料
1.2.1 实验动物 清洁级雄性SD大鼠60只，体重（170±7）g。
1.2.2 胃电极埋植 实验用大鼠麻醉开腹，在胃体-窦交界部埋植单根针形银电极。
1.2.3 糖尿病模型制作方法 手术10天后存活并创伤愈合的大鼠55只，从中随机抽取40只，在禁食12 h后腹腔注射0.1 mol/L柠檬酸缓冲液链脲佐菌素（STZ），剂量55 mg/kg，以制作DM模型；其余15只大鼠为对照组。STZ注射2天后，连续3天在非禁食情况剪尾取血，并应用美国Johnson & Johnson 公司LifeScan ONE TOUCH血糖计测血糖；以血糖>14 mmol/L视为DM造模成功。
1.2.4 实验分组及中药应用 埋植胃电极，DM造模成功并存活的大鼠，随机分为DM模型组（简称DM组）15只，DM模型＋中药组（DM-TCM组）15只；其余埋植胃电极而未造模的15只大鼠为对照组。DM-TCM组大鼠在造模后第5天起，以148%浓度的中药复方糖胃康制剂灌胃，1次/d，1 ml/（100 g体重大鼠·次），相当于临床等效量，为预防性。三组大鼠均以普通颗粒饲料喂养，自由饮水，并进行胃的实验电生理观察2个月。
1.2.5 中药复方糖胃康制剂制备 糖胃康是以健脾养胃、理气活血为主的中药复方，由白术、苏梗、丹参、麦冬、巴戟天、柴胡等中药组成。按复方各中药的临床常用剂量比例，将其制备为水煎剂，浓度14.8%。换算成大鼠实验用等效量，相当于1 ml/（100 g体重大鼠·次），每日1次。
1.2.6 胃电观察与分析 埋植胃电极的三组大鼠，每只隔天在非禁食情况以成都泰盟BL-410型生理实验系统记录胃电1次，每次记录约10 min。参数设置为时间常数5 s，高频滤波100 Hz，X轴速度2.56 s/div。每份胃电记录量度每一波形，基本电节律的平均频率（周/min）和平均波幅（mV），并清点峰电发生的次数，计算峰电发生率（个/min）。对三组大鼠各次胃电记录，将计算所得的基本电节律平均频率、平均波幅和峰电发生率，分别对其记录时间相应的造模后天数作散点图，并作相关分析获得回归方程。
1.2.7 胃动力基本功能单位的细胞病理学研究 实验电生理观察2个月后，三组大鼠全部处死，检查所埋电极的情况，并开腹取胃，分别作胃纵肌-神经铺片、石蜡包埋切片，或锇酸固定包埋半超薄切片，作HE染色，NOS组化染色，碘化锌-锇酸组化染色，nNOS免疫组化染色，或抗c-kit单抗免疫组化染色。光镜或电镜观察胃平滑肌、壁内神经、ICC的数量、分布及超微结构。
2 结果
2.1 一般情况 （1）全部造模大鼠腹腔注射STZ后第7天，除死亡外，其余大鼠的血糖均高于14 mmol/L，造模成功率为95%。（2）埋植胃电极并以STZ制作DM模型的40只大鼠，在2个月后存活19只，死亡率为52.5%。（3）经STZ造模的DM大鼠，其健康状况较对照组明显变差；表现为显著的多饮、多食、多尿，且体重下降，毛色枯槁、精神倦怠、明显懒动，少数尚有腹部溃疡、四肢脓肿发生。
2.2 血糖 造模后第10天即应用中药4天后的血糖检测显示，DM组（11只）为（17.46±2.98）mmol/L，DM-TCM组（12只）为（17.48±3.08）mmol/L，两组的血糖差异无统计学意义，且都明显高于对照组（10只）（3.85±0.78）mmol/L。
2.3 糖尿病模型大鼠的胃电异常及中药作用 实验全过程有多次完好胃电记录，并于实验结束时剖腹检查胃电极在位的大鼠，计有对照组4只、DM组6只、DM-TCM组5只。分析显示，大鼠的胃电主要有基本电节律和峰电两种成分。三组大鼠胃电的特点及分析统计结果如下。
2.3.1 胃电基本电节律频率 经相关分析，三组大鼠胃电的频率Y（次/min）随记录时间X（相应造模后天数）变化的回归方程分别为，对照组Y=4.8004-0.0042 X，DM组Y=4.0893+0.0129 X，DM+TCM组Y=4.0800-0.0064 X。此外，显示，造模后25～35天对照组大鼠的胃电频率为（5.0±1.1）次/min，DM组为（3.9±0.6）次/min，DM-TCM组为（3.7±0.3）次/min。由反映胃电频率随时间变化趋向的散点图、回归方程以及上述结果可知，对照组大鼠胃电的频率随时间推移无明显变化；而经实验性糖尿病造模的DM及DM-TCM组大鼠，在造模后第6天起，其胃电的平均频率（4.09次/min及4.08次/min）则都低于对照组大鼠（4.80次/min），并随时间推移，其胃电频率均处于较低水平。
2.3.2 胃电基本电节律波幅 经相关分析，三组大鼠胃电的波幅Y（mV）随记录时间X（相应造模后天数）变化的回归方程分别为，对照组Y=1.7263-0.0099 X，DM组Y=1.5894-0.0127 X，DM-TCM组Y=1.7882-0.0056 X。比较三组的回归方程可知，随时间推移对照组大鼠的胃电波幅无明显变化。在造模后第6天起，DM组大鼠的胃电平均波幅较对照组大鼠减低，且随时间推移逐渐下降。而灌服糖胃康的造模大鼠，其胃电波幅则与对照组大鼠相近，且随时间推移波幅下降较轻微。
2.3.3 胃电峰电 经相关分析，三组大鼠胃电的胃电峰电发生率Y（个/min）随记录时间X（相应造模后天数）变化的回归方程为：对照组Y=2.2476+0.0090 X，DM组Y=0.5580+0.0464 X，DM-TCM组Y=1.5920-0.0224 X。比较三组的回归方程可知，对照组大鼠的胃电峰电发生率随时间推移无明显变化。在造模后第6天起，DM组大鼠的胃电峰电发生率明显低于对照组。而灌服糖胃康的造模大鼠胃电峰电的发生率则显著高于单纯糖尿病造模大鼠。
2.4 糖尿病模型大鼠的胃肌、壁内神经与ICC病理损害及中药作用 光镜及电镜观察发现，对照组大鼠胃的平滑肌细胞排列整齐，肌细胞内细胞器丰富，线粒体的嵴较多。肌间丛神经元的胞核清晰，细胞器丰富，并有大量线粒体及粗面内质网。神经轴突和树突末梢处密度均匀，神经膨体内有较多的突触小泡。紧邻肌间丛神经元可见ICC，其胞质和突起内含有丰富的线粒体、内质网和发育良好的高尔基器，有膜内陷空泡，核糖体丰富，其胞质突起围绕神经束形成不完整的鞘样结构。壁内神经及ICC的突起相互连接形成，分布均匀。该组大鼠胃的毛细血管壁平滑，内皮细胞完整。DM组大鼠胃的平滑肌细胞排列紊乱，肌细胞内有很多较大的胞质溶解性空泡，线粒体水肿、空泡样变或溶解。在肌间丛可见神经元胞核溶解坏死，胞质部分溶解，线粒体肿胀，嵴溶解，粗面内质网扩张，并部分溶解。神经轴突和树突末梢部分肿胀或溶解，电子密度不均匀，部分明显扩张形成空泡。神经膨体内突触小泡含量明显减少。该组大鼠胃的ICC数量较对照组明显减少。ICC之间、ICC与平滑肌细胞及神经末梢之间的连接显著减少。尚存的细胞间连接结构显示有病理损害，其结构不清，连接松散，或间隙增宽。ICC的线粒体肿胀，可见空泡样变，胞质广泛溶解，核周的细胞质明显减少，胞质内有大量自噬性空泡形成。ICC内细胞器的数量较正常减少，核糖体减少，内质网轻度扩张，粗面内质网脱颗粒，核内异染色质明显。尚发现该组大鼠胃的壁内神经及ICC分布极不均匀，有的视野密集，有的视野稀少，结构不清，连接松散，突起连接杂乱，突起不能连接成网。胃的毛细血管管壁欠平整，管壁增厚、迂曲，部分毛细血管中断，胞质内有小空泡。DM-TCM组大鼠胃平滑肌细胞的排列较DM组整齐，肌细胞内少有较大的胞质溶解性空泡，线粒体肿胀不明显。胃神经轴突和树突末梢处的电子密度尚均匀。肌间丛神经元胞核仍清晰，细胞器仍较丰富，并有较多线粒体和粗面内质网。尚发现该组大鼠胃ICC的数量较糖尿病组为多。ICC之间、ICC与平滑肌细胞及神经末梢之间连接的病理损害较DM组轻，其结构较清晰而紧密。壁内神经及ICC的分布及突起连接，较DM组损害为轻。尚发现该组大鼠胃的毛细血管壁不平，管壁增厚，但迂曲不明显，内皮细胞仍完整。
3 讨论
（1）胃肠动力学认为，胃的平滑肌收缩及动力是由胃电激发的。在基本电节律基础上发生的峰电，通过电-机械耦联机制导致胃肌收缩。因而，埋植电极记录的胃电可作为胃动力的指标。（2）STZ能在大鼠成功制作糖尿病模型。但该法造模并埋植胃电极作慢性电生理研究时，动物的死亡较多。（3）本研究发现，DM造模6天后，造模大鼠胃电的基本电节律频率、波幅及峰电发生率都较对照组大鼠减低，其中胃电波幅尚随造模时间推移而进一步下降。该结果显示，由于DM及其病情的，胃电基本电节律的频率变慢、强度减弱，同时峰电减少，并导致胃动力下降。该结果能从电生理角度，解释DGMD发生的动力学机制。（4）已如前言所述，ICC及其网络存在于胃肠各肌层，是胃肠基本电节律的起搏细胞，并为ENS运动末梢信号向SMC传送的中转调节者。较新的观点将“ENS运动末梢-肌间丛ICC-SMC”视为胃肠动力基本功能单位［2～5］。本研究发现，DM模型大鼠的胃动力基本功能单位有显著的病理损害。这可部分解释DM大鼠胃电异常与DGMD发生的关键性局部病理机制。（5）本实验还观察到，灌服糖胃康的DM大鼠，其胃电波幅、峰电发生率的降低以及胃动力基本功能单位的病理损害都较单纯DM组大鼠为轻。显示糖胃康能明显改善DM大鼠的胃电，并减轻壁内神经、ICC及平滑肌的损害。该结果能从电生理及细胞病角度解释该复方防治DGMD的部分机制。笔者新近的工作显示，这可能与复方糖胃康制剂中健脾活血中药减少非酶糖基化终产物沉积，改善胃的微循环，改善细胞代谢，以及“理气”中药双向调节胃肠动力等作用有关。其具体机制有待进一步研究。
【】
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