高脂血症和动脉粥样硬化不同痰瘀证候患者血浆蛋白质差异表达谱与脏腑功能的关系
作者：宋剑南, 刘军莲, 房祥忠, 胡元会, 雷燕, 牛晓红, 吴刚, 陈保生, 马雅銮, 陈冰, 金红
【摘要】 目的：探讨高脂血症及动脉粥样硬化不同痰瘀证候患者血浆特异性蛋白质群与脏腑功能之间的相关性。
方法：采用中医证候诊断，观察146例高脂血症及动脉粥样硬化不同痰瘀证候病人的脏腑功能状况。获取病人的血浆样品进行二维凝胶电泳，对差异表达蛋白进行二级质谱分析，寻找可区别不同痰瘀证候的特异性标志蛋白群。采用图模型分析方法研究不同痰瘀证候可能的标志蛋白与脏腑功能之间的相关性。
结果：区分高脂血症及动脉粥样硬化病人中医痰证与痰瘀互阻证可能的标志蛋白群中纤维蛋白原γ链、白蛋白及载脂蛋白AI前体主要与心气虚、肾气虚及脾气虚有关；区分痰证与血瘀证可能的4种标志蛋白质中，白蛋白和肾上腺髓质素结合蛋白前体与心气虚、肾气虚均有关，结合珠蛋白前体只与肾气虚有关，并通过肾上腺髓质素结合蛋白前体与心气虚相关，补体C4与之均无关；区分血瘀证与痰瘀互阻证可能的标志蛋白群中白蛋白与心气虚、肾气虚及脾气虚均有关，而肾上腺髓质素结合蛋白前体只与脾气虚相关；区分非痰非瘀类与痰瘀类证候可能的标志蛋白纤维蛋白原β链主要与肾气虚有关，载脂蛋白AI前体主要与肾气虚及心气虚有关。
结论：高脂血症及动脉粥样硬化不同痰瘀证候可能的血浆标志蛋白与不同的脏腑功能之间存在不同的关联组合。
【关键词】 高脂血症; 动脉粥样硬化; 痰证; 血瘀; 血浆蛋白质类; 脏腑
Objective: To investigate the relationship between the plasma biomarker proteins and the states of Zang?Fu organs in patients with phlegm or blood stagnation syndromes due to hyperlipidemia and atherosclerosis.
Methods: The states of Zang?Fu organs in 146 patients with perlipidemia and atherosclerosis were diagnosed by syndrome differentiation of traditional Chinese medicine. The plasma proteins from these patients were separated by two?dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2?DE). Differential protein profiling was established by Image Master 6.0 software, and the differential proteins were analyzed by quadrupole time of flight mass spectrometry (Q?TOF?MS). The association between the plasma biomarker proteins and the states of Zang?Fu organs was analyzed by graphical models.
Results: The biomarker proteins such as fibrinogen gamma chain, albumin and apolipoprotein AI (precursor) in discrimination of the patients with phlegm syndrome from phlegm accumulating with stagnation syndrome were correlated with the deficiency of kidney?qi, heart?qi and spleen?qi. Among the four biomarker proteins in discrimination of the patients with phlegm syndrome from blood stagnation syndrome, albumin, adrenomedullin binding protein (precursor) and haptoglobin (precursor) were correlated with the deficiency of kidney?qi and heart?qi, but complement component C4 was independent of the deficient Zang?Fu organs. The biomarker albumin was associated with the deficiency of kidney?qi, heart?qi and spleen?qi, and adrenomedullin binding protein (precursor) was correlated with the deficiency of spleen?qi in discrimination of the patients with blood stagnation syndrome from phlegm accumulating with stagnation syndrome. As the potential biomarker proteins in discrimination of the patients with non?phlegm and non?stagnation syndrome from phlegm accumulating with stagnation syndrome, the fibrinogen beta chain was related with the deficiency of kidney?qi, and apolipoprotein AI (precursor) was correlated with both the deficiency of kidney?qi and heart?qi.
Conclusion: There exists inherent correlation between the states of Zang?Fu organs and the plasma probable biomarker proteins in the patients with different phlegm or blood stagnation syndromes due to hyperlipidemia and atherosclerosis.
Keywords: hyperlipidemias; atherosclerosis; phlegm syndrome; blood stagnation; plasma proteins; Zang?Fu organs
高脂血症属中医痰浊范畴。中医学认为，痰浊系人体脏腑气血失和，水谷津液运化失常所致。血脂和脂蛋白代谢紊乱是血中痰浊的重要生化物质基础［1］。研究显示，痰证患者有明显的血液流变学改变，主要表现为血浆流动性降低、聚集性增高和成分异常。同时，痰证患者血液流动性降低、聚集性增高导致了血液流变性质的改变，此种改变被认为是血瘀。痰瘀互结，胶着脉道，这便是中医学所认识的动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）的主要病机。有临床研究指出，至少40％以上的AS或冠心病患者属于痰瘀兼证［2］，这是我们将高脂血症及AS与中医痰瘀证候结合起来研究的根据。本文旨在对已发现的不同痰瘀证候可能的标志蛋白群进行分析，研究其与脏腑功能的相互关系。
1 资料与方法
1.1 诊断标准 高脂血症的诊断按1997年中华心血管病杂志编辑委员会血脂异常防治对策专题组《血脂异常防治建议》标准［3］（甘油三酯＞2.3 mmol/L，总胆固醇＞6.2 mmol/L，符合其中一项即可诊断为高脂血症）；AS的诊断参照美国心脏病协会AS诊断及分类标准［4］。中医证候诊断国家技术监督局发布的《中医临床诊疗术语》国家标准GB/T1675.12?1997［5］。痰证：痰浊内阻，以咳嗽气喘、咯痰量多、呕恶眩晕或局部有圆滑肿块、苔腻、脉弦滑等为常见症；血瘀证：瘀血内阻，血行不畅，以局部出现青紫肿块、疼痛拒按，或腹内癥块、刺痛不移、拒按，或出血紫暗成块、舌紫或有斑点、脉弦涩等为常见症；痰瘀互（搏）结证：痰浊瘀血相互搏结，以局部肿块刺痛，或肢体麻木、痿废、胸闷痰多或痰中带紫暗血块、舌紫暗或有斑点、苔腻、脉弦涩等为常见症；气虚证：元气不足，脏腑机能衰退，以气短乏力、神疲懒言、自汗、舌淡、脉虚等为常见症；心气虚证：心气虚弱，运血无力，以心悸气短、精神疲倦、舌淡紫、脉弱等为常见症；脾气虚证：脾气虚弱，以神疲、头晕、健忘、食少、腹胀、便溏、舌淡、脉弱等为常见症；肾气虚证：肾气虚弱，以腰膝酸软、夜尿多、小便不尽、舌淡、脉弱等为常见症；肝气虚证：肝失疏泄，以两胁胀闷、情绪低沉、疲乏气短、头晕眼花、舌淡、脉弱等为常见症。
1.2 纳入标准 （1）符合高脂血症和（或）AS疾病诊断标准；（2）符合中医证候诊断标准中血瘀证和（或）痰证的诊断。
1.3 排除标准 （1）不符合痰证、血瘀证诊断标准者；（2）不属于脾、肾、心气虚和肝气虚（滞）。（3）肾病综合征、肝胆疾病及糖尿病、内分泌功能紊乱和造血系统疾病患者。（4）半年内患急性心肌梗死、脑血管意外、严重创伤或大手术者。（5）近1个月内服过调脂、活血、抗AS药物或因其他疾病正在服药者。（6）哺乳、妊娠期妇女。（7）由药物引起的高脂血症。
1.4 一般资料 2004年5月～2005年8月，从中医院广安门和西苑医院心内科收集符合上述纳入标准的常住北京地区35～55岁的汉族患者共146例，其中，男61例，女85例。证候分类为痰证32例，血瘀证38例，痰瘀互阻证41例，非痰非瘀类证35例。
1.5 实验方法 采用美国BD公司真空采血器，空腹清晨采血4.0 ml，30 min内分离血浆，－80 ℃冰箱保存。用美国GE公司的Ettan IPGphorⅡ聚焦系统进行第一向等电聚焦。取20 μl血浆样品与300 μl重胀液混合，与pH 3～10和18 cm的非线性胶条重胀聚焦。等电聚焦步骤：12 h重泡胀，24 h梯度升压至8 000 V，聚焦95 500 vhs。等电聚焦结束后，胶条在含1％ 2?巯基苏糖醇和2.5％碘乙酰胺10 ml平衡液中进行二步平衡。平衡好的IPG胶条转入预制的15％聚丙烯酰胺凝胶板上部，进行第二向十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS?PAGE）。分析胶采用考马斯亮蓝染色（按Neuhoff胶体考马斯亮蓝G?250的方法进行）。染色后的胶用美国UMax公司Labscan凝胶图像扫描仪扫描，然后用Image Master 6.0图像分析软件对血浆双向电泳图谱进行差异分析，比较蛋白斑点的数量及蛋白表达量，获取不同证候的差异蛋白质表达谱和区别不同痰瘀证候的可能的标志蛋白群，经二级质谱对这些标志蛋白质进行分析和数据库检索，确定蛋白质性质（另文发表）。
1.6 统计学方法 采用图模型分析方法分析区分不同痰瘀证候可能的标志蛋白与脏腑功能的相互关系。图模型是一种用图来表示模型的多元统计分析方法，通过图中各个结点以及它们之间的边来表示变量之间的相互关系。它可以综合地考虑所有变量，得出多个变量之间的相互关系，能更准确地把变量之间深层次的关系表达出来，从而优于以往的统计分析方法。图模型包括离散变量模型、连续变量模型和既有离散变量又有连续变量的混合模型3种。在图模型中，每一张图都是由结点和它们之间的边所组成。每一个结点代表一个变量，每两个结点之间是否有边代表了它们是否具有明显相关性。
2 结果
2.1 不同痰瘀证候患者血浆的蛋白质组学 前已发现区分痰证与痰瘀互阻证可能的标志蛋白主要有纤维蛋白原γ链、白蛋白和载脂蛋白AI前体；区分血瘀证与痰证可能的标志蛋白主要有结合珠蛋白前体、肾上腺髓质素结合蛋白前体、补体C4和白蛋白；区分痰瘀互阻证与血瘀证可能的标志蛋白主要有白蛋白和肾上腺髓质素结合蛋白前体；区分非痰非瘀类证候与痰瘀类证候可能的标志蛋白主要有载脂蛋白AI前体和纤维蛋白原β链（详细研究结果将另文发表）。
2.2 不同痰瘀证候患者的脏腑功能分布 对纳入的146例高脂血症及动脉粥样硬化不同痰瘀证候病例进行分析，发现同一证候可以兼有一种或多种脏腑的功能衰退。见表1。
表1 不同痰瘀证候脏腑功能变化频数表（略）
Table 1 Frequency of the states of Zang?Fu organs in the patients with phlegm or blood stagnation syndromes
2.3 不同痰瘀证候患者蛋白质组学与脏腑功能的相关性 对上述区分不同痰瘀证候可能的标志蛋白，采用图模型分析方法，分析其与脏腑功能的相关性。见图1。图中两点的连线表示二者具有相关性（P<0.05）；两点间无连线表示二者不相关。结果发现：（1）区分痰证与痰瘀互阻证可能的标志蛋白纤维蛋白原γ链（1481）、白蛋白（1539）和载脂蛋白AI前体（1635）与心气虚、肾气虚及脾气虚均有关；（2）区分血瘀证与痰证可能的4种标志蛋白中，白蛋白（1666）和肾上腺髓质素结合蛋白前体（1563）与心气虚、肾气虚均有关，结合珠蛋白前体（1521）只与肾气虚有关，并通过肾上腺髓质素结合蛋白前体与心气虚相关，未发现补体C4（1688）与脏腑功能间的相关性；（3）区分痰瘀互阻证与血瘀证可能的标志蛋白白蛋白（1456）与心气虚、肾气虚及脾气虚有关；肾上腺髓质素结合蛋白前体（1563）只与脾气虚相关；（4）区分非痰非瘀类证候与痰瘀类证候可能的标志蛋白纤维蛋白原β链（1383）与肾气虚有关，载脂蛋白AI前体（1635）与肾气虚及心气虚均有关。
图1 不同痰瘀证候患者标志蛋白与脏腑功能的相关性（略）
Figure 1 Relationship between the plasma biomarker proteins and the states of Zang?Fu organs in the patients with phlegm or blood stagnation syndromes
A: Phlegm syndrome; B: Blood stagnation syndrome; C: Phlegm accumulating with stagnation sydrome; D: Non?phlegm and non?stagnation syndrome.
3 讨论
中医学认为高脂血症和AS当属本虚标实之证。本虚主要是脏腑虚损，元气不足，是本病的关键，其中尤以脾、肾、心、肝虚损为主；标实指痰浊和瘀血交阻而内留。若脾虚气弱，脾运不健，水谷精微不归正化，酿生痰浊，痰浊积聚体内，会导致高脂血症的产生，故中医学有“脾为生痰之源”之说。由于痰之本在于肾，肾虚不能温煦脾阳，痰浊内生；同时肾阳主一身水液的变化，肾阳虚衰，五脏功能减退，水液输化失常，直接影响人体的新陈代谢和水液的排泄，从而引起血脂的异常。心气不足或心阳虚衰，不能温运血脉，可引起血脉不通，瘀血阻滞而致动脉粥样硬化。肝主疏泄，气行则津行，气滞则湿阻。肝失疏泄，横逆犯脾，肝脾失调导致阴阳气血失和，痰浊中生，久则痰瘀互阻，阻滞血脉。脾、肾、心及肝功能失调，均可以使膏脂输布障碍，导致膏脂过多，渗入血中，致痰浊为患，痰浊存在于血脉，使脉络壅滞不畅，痰瘀互结，而导致胸痹、眩晕、心悸和头痛等病症。
应用蛋白质组学方法， 获得了可区分高脂血症及动脉粥样硬化不同痰瘀证候可能的标志蛋白群［6］。初步证明了“证候的特异性以及证候病机的生物学基础是不同分子在特定时空条件下的特定组合”的假说［7］。本研究进一步采用图模型分析方法分析不同痰瘀证候可能的标志蛋白与脏腑功能的相互关系，发现了可区分非痰非瘀类证候与痰瘀类证候的2种标志蛋白，一种与肾气虚有关，另一种与肾气虚及心气虚均有关；可区分痰证与痰瘀互阻证的3种标志蛋白与心气虚、肾气虚及脾气虚均有关；可区分痰证与血瘀证的4种标志蛋白中有2种标志蛋白与心气虚和肾气虚均有关，一种标志蛋白只与肾气虚有关，但可通过另一种标志蛋白与心气虚相关，还有一种标志蛋白与脏腑功能无关；可区分血瘀证与痰瘀互阻证的2种标志蛋白中，一种与心气虚、肾气虚及脾气虚均有关，另一种只与脾气虚相关。提示区分不同证候的不同标志蛋白与不同的脏腑功能、不同临床表征和不同致病因素有不同相关性和差异组合，即同一证候的不同标志蛋白可能源自不同致病因素和不同脏腑的功能紊乱。其中，既有某一致病因子和临床表征及脏腑功能紊乱与一种或多种标志蛋白相关的情形，也有一种标志蛋白可能与多种致病因子和临床表征及脏腑功能紊乱相关的情形，同时还存在少数标志蛋白与脏腑功能紊乱无直接相关的情况；这一结果表明证候的形成和不仅与脏腑功能而且也与其他因素存在复杂的组合关系，同时也进一步证明同病异证是特定时空条件下不同脏腑功能紊乱所致［7］。本项研究结果不仅为脏腑功能的变化与证候演变的相互关系提供了蛋白质组学的初步证据，也为微观指标对宏观辨证的诠释和中医证候的基础研究提供了新的启示。
【】
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