P16、 Ki67在宫颈病变中的表达及意义
作者：王佩飞 陈建武 黄巨丹 陈良英
【关键词】 P16 Ki67 宫颈病变 表达
宫颈癌是严重威胁妇女健康的恶性肿瘤，占妇女恶性肿瘤的首位，其发病率有逐年上升和发病年轻化的趋势，对宫颈癌的早期诊断、早期，尤其在癌前病变人群中发现癌变的高危个体，开展针对性较强的重点预防，降低宫颈癌的发病率和死亡率，具有重要意义。本次研究采用免疫组化方法检测P16基因、Ki67抗原在宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia ,CIN）和宫颈鳞癌组织中的表达情况，探讨与宫颈癌发生的关系。报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 收集乐清市人民2004年6月至2008年10月间宫颈活检、宫颈Leep术及子宫全切标本100例，患者年龄28～65岁，平均年龄(42.12±3.12)岁。其中CINⅠ～Ⅲ级患者70例，年龄28～60岁，平均年龄（42.20±3.61）岁；鳞癌30例，年龄30～65岁，平均年龄（41.93±3.08）岁；20例患者正常宫颈黏膜来自子宫平滑肌瘤的手术切除标本，年龄32～70岁，平均年龄（42.60±3.50）岁。三组的年龄差异均无统计学意义（P均＞0.05）。
1.2 方法 全部组织经10％中性福尔马林固定，石蜡包埋，4um厚连续切片，免疫组化染色采用EnVision二步法，DAB显色，以PBS缓冲液（0.01mol/L，pH7.4）代替第一抗体作阴性对照，用已知阳性组织切片作阳性对照。所用单克隆抗体P16、Ki67、EnVision试剂盒及DAB显色剂均由Dako公司生产。操作按EnVision试剂盒说明进行。
1.3 结果判定 根据Dako公司产品说明，P16阳性为胞核和/或胞浆着色，无棕黄色颗粒者为（-）；棕黄色细颗粒为（+）；棕黄色粗颗粒为(++)；棕褐色粗颗粒为（+++）。Ki67阳性为胞核着色，阳性细胞仅位于基底层及副基底层或阳性细胞数≤5％者为（-）；阳性细胞数6％～25％者为（+）；26％～50％者为（++）；＞50％者为（+++）[1]。本次研究以阳性强度在（+）以上者列为阳性表达。
1.4 统计学方法 采用SPSS 16.0统计学软件。计量资料以均数±标准差（■）表示。计数资料采用卡方检验；相关关系的分析采用Pearson积差相关分析法。设P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 P16、Ki67在宫颈各组病变组织中的表达比较结果见表1
由表1可见，鳞癌组和CIN组的P16、Ki67阳性率与对照组比较，差异均有统计学意义（χ2分别=45.97、46.40、45.97、51.73，P均＜0.05）；CINⅡ、CINⅢ组的P16、Ki67阳性率与CINⅠ组比较，差异均有统计学意义（χ2分别=12.50、10.29、9.52、7.78，P均＜0.05）。
2.2 宫颈CIN组与鳞癌组中P16、Ki67表达的相关性见表2
由表2可知，经Pearson积差相关分析法分析，P16、Ki67在宫颈CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ及宫颈鳞癌组中表达呈正相关（r＝0.51，P＜0.05）
3 讨论
目前认为，宫颈癌尤其是鳞癌的发生是一个从异型增生到原位癌，最后发展为浸润性癌的渐进过程。在此过程中，多个癌基因的激活和抑癌基因的失活起着重要作用。
P16基因是人们发现的第一个直接作用于细胞周期、抑制细胞分裂的基因，位于人类染色体9p21区，由三个外显子和两个内含子构成，长约8.5kb[2]，是从细胞周期素依赖性激酶4（cyclin－depedent kinase,CDK4）结合相互作用的蛋白质的研究中被发现和分离出来的。若其编码基因因甲基化、缺失等原因使细胞内P16蛋白减少，会引起细胞周期调节紊乱，使细胞无限制增生，甚至癌变，因此，P16被认为是一个抑癌基因。但进一步研究却发现，宫颈癌的发生及并不涉及P16基因甲基化或缺失，在57％的宫颈癌病例中存在P16基因的高表达，且会随着宫颈癌病情的发生发展而呈现逐渐升高的趋势[3]。本次研究结果显示，在正常宫颈组织中P16蛋白表达率极低，而在CIN组及鳞癌组中表达率明显增高（P＜0.05），且随着病变组织学分级的增加，P16在宫颈CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ组阳性表达率呈升高趋势（P＜0.05），提示P16的高表达与宫颈癌的发生、发展有密切关系。同时还发现，P16的表达有明显的分层现象，CINⅠ阳性细胞主要局限于鳞状上皮下1/3层，而CINⅡ、CINⅢ则超过上皮层的下2/3或达全层，据此可以对CIN病变进行更客观准确的分级，有较好的临床应用价值。因此，P16被认为是宫颈上皮内瘤变和宫颈癌的具有敏感性和特异性的标志物，可作为宫颈病理和宫颈细胞学诊断的补充检查[4]，并有助于对CIN病人的转归及宫颈癌病人预后的判断[5]。
Ki67抗原是针对处于增殖周期的人类细胞核抗原，因其半衰期短，检测结果明显优于半衰期长的增殖细胞核抗原，被视为较可靠且全面反映细胞群体增殖活性的指标[6]。正常宫颈上皮Ki67阳性细胞集中在基底层或副基底层，随着增生的不成熟鳞状上皮的增多，Ki67阳性细胞数量也明显增多。因此，判定宫颈病变除了观察Ki67表达强度外，最重要的是观察其出现的部位，如CINⅠ时，Ki67阳性细胞局限在上皮层下1/3，而CINⅡ－Ⅲ则大量的上皮表层细胞出现Ki67阳性。本次研究用Ki67表达来进一步验证宫颈从正常黏膜至CIN至鳞癌这一发展演进过程中的变化，结果显示：Ki67在CIN组和鳞癌组中的表达率显著高于正常宫颈组织（P＜0.05），且随着病变严重程度的增加而表达率增高。而且，Ki67的阳性表达及其分布层次与CIN分级密切相关，表明宫颈癌的发生发展与细胞增殖有关，且对鉴别良恶性疾病及预测良性病变是否癌变有价值，有利于选择恶性肿瘤的早期方法和疗效的评估。
本次研究经相关分析法分析显示，P16、Ki67阳性表达率在宫颈CIN组、鳞癌组中具有显著正相关性（P＜0.05），结果与报导一致[7]，提示宫颈肿瘤的发生是一个多基因突变的结果，并提示P16、Ki67在宫颈癌的发生发展中具有协同作用，联合检测P16基因和Ki67抗原在宫颈组织中的阳性表达，能协助诊断宫颈上皮内病变、宫颈鳞癌，并可作为CIN分级诊断的辅助方法，有较好的临床应用价值。
【参考文献】
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3 Klaes R, Friedrich T, Spitkovsky D, et al. Overexpression of P16(INK4A) as a specific marker for dysplastic and neopla-stic epithelial cells of the cervix uteri[J]. Int J Cancer, 2001, 92(2):276－284.
4 黄惠英, 钱德英, 岑坚敏. 免疫组化P16蛋白在不同级别宫颈病变中表达差异的研究[J].，2008,8(3):14－15.
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7 何慧仪, 卢丽娜, 杜洪, 等. Ki67、Survivin、P16表达在宫颈癌和宫颈癌前病变诊断中的意义[J]. 妇幼保健, 2006, 21（13):1825－1827.
