裸鼠肝癌T淋巴细胞免疫功能重建模型的建立

【关键词】  肝癌

    在肝癌的中，T细胞免疫在肿瘤免疫中起着重要的作用。尽管肝癌组织存在淋巴细胞的浸润，但是这并没有使肝癌的病情进展速度减缓。所以关于淋巴细胞在肿瘤患者体内的功能变化特别是T淋巴细胞在肝癌患者体内的免疫作用值得进一步的研究。目前，一直缺少一个有效而且特异性强的研究模型。从而造成研究的影响宿主免疫状态因素增多，增加了研究的难度。本研究在裸鼠体内建立起一个以T细胞免疫功能重建为基础的模型，为进一步进行免疫与肿瘤的转移和复发的关系提供实验平台。

    1资料和方法

    1.1细胞系与培养 小鼠高淋巴高转移潜能细胞株（Hca-P）和低转移潜能细胞株（Hca-F）购于大连医科大学。在含有10%小牛血清的RPMI1640（Invitrogen，LifeTech.，美国）中，置于37℃、含有5%CO 2 温箱中常规培养、传代。或者接种于615小鼠腹腔，4天后形成腹水，取腹水，分离肿瘤细胞传代。

    1.2动物的饲养 BALB/c nu/nu雄性裸小鼠，4-6周龄，体重20g左右，置于层流式超净架内的有机玻璃饲养盒内（5只/盒），在恒温（25-27℃）、恒湿（45-50%）、无特殊病原菌（SPF）级环境下饲养。灭菌处理的水和饲料供动物自由摄入。

    615小鼠，雄性，4-6周龄，体重20g左右，饲养于复旦大学中山实验动物中心。

    1.3小鼠T淋巴细胞的提取 取2只4周龄Balb/c雄性小鼠，引颈处死，无菌取胸腺，放于不含小牛血清的RPMI1640中，于200目金属网上研压，收集网下细胞悬液注入无菌离心管中，用不完全培养液洗涤2次并重新悬浮。

    将悬浮的细胞再次离心，计数，与淋巴细胞分离 液（1.077A，批号:10110487，AXIS-SHIELD PoC AS，Norway）按照细胞悬液:分离液=2∶1的体积小心将细胞悬液加于分离液上方，分层放置。再于600g水平离心20min。小心取出离心管，吸取中间的单个核细胞层，用PBS重新悬浮，并计数。

    将分离的单个核细胞用T淋巴细胞分离柱（CEDARLANE，Canada）进行分离，方法详见说明书。收集分离到的T淋巴细胞，进行下一步的实验。

    1.4 T淋巴细胞免疫体系在裸鼠体内的建立 取42只Balb/c nu/nu雄性裸小鼠，分为4组。分别是高转移重建组（P1），高转移未重建组（P2），低转移重建组（F1），低转移未重建组（F2）。第1天取T淋巴细胞分别经尾静脉注入小鼠体内。每只小鼠0.3ml，含细胞数量为（6～8）×10 6 个。此后，每周尾静脉注射T淋巴细胞1次，3周后处死小鼠。

    1.5 T细胞免疫功能重建效果的评价 淋巴细胞表型的鉴定:分别取高、低转移组的小鼠的外周血淋巴细胞以及脾细胞（分离方法同上），配制成大约1×10 6 /ml，按照10 6 细胞量加入10μl小鼠CD3、CD4、CD8流式抗体（eBioscience Inc.），避光反应30分钟后，流式细胞仪（Becton Dickinson，USA）检测CD3、CD4、CD8细胞的百分比。每组随机抽取7例样本进行检测。

    1.6淋巴细胞功能的检测 采用混合淋巴细胞反应，进行体外实验。分别于无菌条件下取两只免疫重建后的裸鼠脾脏以及未进行免疫功能重建的裸鼠脾脏，按照上述程序分离单个核细胞。进行混合淋巴细胞反应。

    1.7统计方法 采用SPSS11.0对实验结果进行单因素方差分析以及秩和检验。

    2结果

    2.1 T细胞免疫功能重建前后细胞表面标志物的变化 裸鼠T细胞免疫功能重建后的CD4/CD8与对照组相比有明显的差异（P<0.05）。其中免疫功能重建后裸鼠外周血、脾脏的CD3、脾脏CD4的绝对百分比、脾脏CD4/CD8均高于免疫功能未重建组（P<0.05）。CD8的绝对百分比在免疫重建组与对照组 相比没有显著性差异（P>0.05），见表1。流式细胞仪检测免疫功能重建后高、低转移组的CD4、CD8波峰大小均高于免疫功能未重建组（图1）。

    图1 流式细胞仪检测T细胞免疫功能重建前后裸鼠外周血淋巴

    细胞标志物变化

    2.2 T细胞免疫功能重建前后免疫细胞功能检测见表2。免疫功能正常的接种高（P）、低（F）转移细胞株的T细胞与相应的肿瘤细胞进行混合淋巴细胞反应后，其cpm值均低于未重建组的cpm值。其中在高转移组（P组）的cpm值明显小于对照组（P<0.05）。

    3讨论

    肿瘤的转移与免疫之间的关系一直是研究的热点之一。肝癌的转移和复发与基因的突变有关，也与机体的免疫状态有关 ［1，2］ 。肝癌复发转移的研究将建立在生物学的基础上，在方面，肝癌根治性切除 后生物治疗可能占重要地位，尤其是在提高机体免疫功能方面。不论从整体角度研究免疫治疗还是在微观角度研究，对肝癌而言，均需要建立一个可以进行研究的模型。

    目前，研究者建立了各种模型进行肿瘤转移的研究 ［3-8］ 。关于肝癌转移研究的模型也进行了探讨 ［9］ ，但是关于肝癌免疫研究的模型目前尚缺乏。本研究利用T细胞免疫功能重建在裸鼠体内建立起一种新型研究的模型。该模型利用正常Balb/c小鼠的胸腺细胞建立在无胸腺的Balb/c nu/nu裸鼠体内，具有以下特点:①两种小鼠种系相同，高、低转移的细胞株亦是小鼠来源，排除了MHC限制性对研究的影响;②本模型在裸鼠体内较为单纯地模拟了T细胞免疫功能的重建，经过流式细胞仪检测裸鼠的外周血和脾脏T淋巴细胞的表达，证实了该免疫重建模型的有效性;③本研究利用胸腺细胞进行免疫功能重建，可以较好的模拟免疫环境，便于深入进行研究。可以为今后进一步进行肿瘤免疫方面的研究提供。

    但是在研究中我们发现，免疫重建后裸鼠外周血及脾脏T淋巴细胞绝对比例数值不高，淋巴细胞杀伤肿瘤细胞功能并不理想。分析可能系以下原因:①采集标本的时间与重建时间间隔较长或免疫功能重建所用胸腺中native T细胞进行阳性选择大量死亡所致;②肝癌细胞是否存在杀伤免疫细胞的机制尚不清楚，但是肿瘤细胞对免疫细胞的抑制作用已经有大量的研究 ［10，11］ ;③本免疫重建模型建立的方法还不够完善，有待于进一步摸索。此亦为今后模型进一步改进的方向。但是，该模型的建立为深入研究肝癌转移的免疫学因素及手段提供了实验平台。

【参考】
  1TaborE.Livertumors andhostdefense.SeminLiverDis，1997， 17（4）:351-355.

2Lau AH，Thomson AW.Dendritic cells and immune regula-Clinical Education of General Practice May2007，Vol.5，No.3