胰岛素受体在糖尿病大鼠心肌组织中的表达
【摘要】 目的通过研究胰岛素受体（insulin receptor，IR）在链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠模型中心肌组织中的表达，探讨IR与糖尿病性心肌病发病机制的关系。方法成年Sprague-Dawley雄性大鼠20只，成实验组和对照组。实验组用链脲佐菌素诱导产生糖尿病模型，4周后对各组大鼠心肌进行IR免疫组织化学染色，观察IR在糖尿病大鼠和正常大鼠左心室心肌细胞中的表达差异。结果发现糖尿病大鼠中心肌间质纤维增生，心肌间微血管壁增厚，IR表达阳性心肌细胞的数目为（9.42±2.32）个/mm 2 及其光密度均为（66.58±6.32）较正常对照组减少（t分别=17.24、8.75，P均<0.05）。结论糖尿病心肌病可作为一种特异性的病变为心肌自主神经系统的紊乱和冠脉血流储备的障碍。IR表达阳性心肌细胞减少可能会造成心肌糖代谢的损害与心力衰竭的发生。
【关键词】 糖尿病 心肌细胞 胰岛素受体
【Abstract】 Objective To investigate the expression of insulin receptor（IR）in diabetic model induced by streptozo-tocin.Methods TwentyadultmaleSprague-Dawleyratsweredividedintotwogroupsatrandom.Indiabeticgroup，therats wereinducedtodiabetesbystreptozotocininjection.Aftercontinuousfeedfor4weeks，theseanimalswerekilledandthehearts weretakenout.ThefreezesectionsofthesetissueswerestainedwithIRimmunohistochemistrymethod.Results Compared withcontrolgroup，Wefoundfibrosisofmyocardialcell，microvesseldissepimentthickeningandthedensitiesandnumbersofIR immunostainingpositivemyocardial cell inleftventricle showed a significantdecrease intheheartofdiabeticrats（t=17.24，8.75，P<0.05）.Conclusion Diabetes cardiomyopathywill develop to automatic nervous disorder in myocardium and coronaryarteryblood currentdisturbance.The down-regulationofIRinthe leftventriclemyocardiumindiabeticmodelmay relatetopathologic changesofdiabeticheartdisease，suchasmyocardialglycometabolismimpairmentandmyocardialfailure.
【Keywords】diabetes;myocardial cell;insulinreceptor
1材料与方法
1.1材料Sprague-Dawley雄性大鼠20只（由浙江大学实验动物中心培育），体重200～300g，6月龄。试剂包括:链脲佐菌素（STZ）（由美国SIGMA公司生产）、Medisense血糖仪（由美国雅培制药公司生产，OptiumQA2583-3364）、兔抗大鼠IR多克隆抗体（由武汉博士德公司生产）、生物素标记的羊抗小鼠IgG及抗生物素蛋白—辣根过氧化物酶复合物（由中国武汉博士德公司生产）。采用UTHSCSA Image Tools3.0（由美国德克萨斯大学医学院开发）图像分析处理系统进行分析。
1.2方法
1.2.1 糖尿病模型的建立和分组 Sprague-Daw-ley雄性大鼠20只随机分为两组:正常组和糖尿病组，每组10只。大鼠禁食10h后，正常组大鼠尾静脉注射pH4.6，0.1mmol/L枸橼酸钠缓冲液，剂量为3ml/kg。糖尿病组大鼠尾静脉注射1%链脲佐菌素枸橼酸钠缓冲液（pH4.6，0.1mmol/L），剂量为3ml/kg。48h后尾静脉取血，测定其空腹血糖及尿糖，将血糖高于16.7mmol/L，尿糖++以上的大鼠定为糖尿病模型。至此，糖尿病模型建立成功，以后每周测尿糖，每2周测血糖 ［4］ 。
1.2.2 两组动物处死前以1%戊巴比妥钠（40mg/kg）麻醉，打开胸腔，经左心室向升主动脉内插管灌注0.9%氯化钠注射液及4%冷多聚甲醛固定液。取出心脏放入相同固定液内后固定4h，后浸入30%蔗糖溶液中置于4℃冰箱24h。用冰冻切片机切心脏横断面切片（厚18μm），然后贴附于涂有铬矾明胶的载玻片上。
1.2.3免疫组织化学染色 将冰冻切片以缓冲液PBS洗3次，3%H 2 O 2 孵育5min，PBS洗3次，每次5min，再经1%牛血清白蛋白孵育30min后，倾去血清放入第一抗体液（兔抗大鼠IR多克隆抗体1:200），玻片在湿盒内4℃孵育过夜，以PBS洗3次，每次5min。然后加入第二抗体液（生物素标记的羊抗兔IgG1:200），置于室温2h，以PBS洗3次，每次5min。加入第三抗体液（抗生物素蛋白—辣根过氧化物酶复合物1:400）室温2h，以PBS洗3次，每次5min。以二甲基联苯胺（DAB）显色，显色3～7min，镜下标记物质呈棕黄色，后常规干燥、透明、树胶封片。正常组实验切片 不加第一抗体孵育，其它步骤相同。
1.2.4图像分析 每只大鼠取1张相同部位DAB染色的心脏切片，进行IR测定。采用UTHSCSA Image Tools3.0图像分析处理系统进行分析，统计各张切片单位面积内（mm 2 ）阳性细胞的数量和光密度。
1.2.5 统计学方法采用SPSS10.0统计学软件。计量资料采用均数标准差（±s）表示。与正常组大鼠比较，采用配对资料的t检验。设P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1血糖与尿糖 糖尿病大鼠成模体重和血糖检测结果见表1。
由表1可见，成模4周时，糖尿病组大鼠与正常组大鼠体重和空腹血糖的比较，差异有统计学意义
（t=8.46、8.70，P<0.05）。
2.2心肌组织的病理变化 糖尿病组和正常组的心肌组织HE染色可见，与正常对照组相比，糖尿病大鼠心肌组织间质疏松，心肌细胞间间质较正常对照组增宽，心肌有肥大、萎缩和玻璃样变性、并可见灶性坏死见封三图11。
2.3心肌细胞中IR含量的变化IR免疫组织化学染色后，镜下可见心肌细胞出现棕黄色颗粒为IR阳性细胞。正常组心肌中有IR表达，糖尿病组心肌细胞中有少量IR的表达，很少见棕黄色染色颗粒，见封三图12。
2.4用UTHSCSAImageTools3.0图像分析系统测定心肌单位面积（mm 2 ）内的IR表达阳性细胞数和阳性细胞光密度值见表2。
IR在糖尿病组大鼠心肌细胞与正常组大鼠心肌阳性细胞表达数和阳性细胞光密度的比较，差异有统计学意义（t分别=17.24、8.75，P均<0.05）。
3讨论
大量流行病学的调查和研究发现，糖尿病患者心血管系统的发病率、病死率较非糖尿病患者高2～3倍 ［5］ 。而糖尿病性心肌病是其中重要而独特的一种。其心肌的病理表现为心肌细胞肥大、心肌局灶性坏死、纤维化和心肌血管壁增厚;在心功能方面表现为限制性心肌病 ［6］ ，即病变早期心室肌舒张功能异常，同时或随后出现收缩功能不足，最终可导致充血性心力衰竭，从而死亡。
糖尿病高血糖心肌细胞胰岛素受体缺乏的状态下，细胞多元醇代谢通路激活，使山梨醇聚集，肌醇代谢紊乱，细胞内Na + -K + -ATP酶活性下降，导致细胞内葡萄糖转运障碍，能量依赖性钙泵（即Ca 2+ -ATP酶）活性下降，导致细胞内Ca 2+ 超载，引起心肌细胞结构与功能受损。高血糖还可上调蛋白激酶C，而心肌蛋白激酶C特异地过度表达可致左心室肥厚，左室活动受限，心肌坏死 ［7］ 。
此外研究发现，高糖环境能够直接引起正常心肌细胞产生糖尿病心肌病变，即舒张期延长以及心肌细胞收缩力下降。这种结论在体内与体外实验同时获得证实。在正常情况，心肌活动所需的能量以游离脂肪酸、葡萄糖为主。但在缺血缺氧情况下心肌不能进行游离脂肪酸的氧化，细胞所需能量大部分来源于葡萄糖的无氧酵解，任何限制葡萄糖获得和利用的因素都将影响心功能。本次研究结果表明，心肌细胞IR受体缺失，可以使心肌组织中葡萄糖有氧氧化和无氧酵解过程发生障碍，进入心肌细胞分解产能的葡萄糖流量减少，心肌细胞糖代谢低下，导致其结构和功能受损。
综上所述，本次研究结果证实，IR很可能通过胰 岛素信号途径参与糖尿病性心肌病的发病，而本次研究的结果也观察到，IR免疫反应阳性细胞在糖尿病组大鼠心肌中明显减少，提示胰岛素受体的减少可能导致胰岛素型号途径的缺陷，这种缺陷可能在糖尿病心肌病中起到重要的作用。这些都为今后从源头上防治糖尿病性心肌病提供了一定的实验依据。
【】
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