甲状腺乳头状癌TGF-β1、nm23-H1、CD31表达及其与肿瘤转移的关系

                             作者：方海飞　丁国芳　徐银峰

【摘要】  研究甲状腺乳头状癌组织中TGF-β1、nm23-H1和CD31的表达水平及其与甲状腺癌转移的关系。方法 应用EnVisionTM免疫组织化学法检测55例甲状腺乳头状癌和10例癌周组织TGF-β1、nm23-H1和CD31的表达；并计数CD31标记的肿瘤组织微血管密度（MVD）。结果 甲状腺乳头状癌组织中TGF-β1阳性表达率76.37％、nm23-H1阳性表达率65.46％，均高于癌周组织，两者之间的差异有统计学意义（χ2分别=16.64、10.61，P均＜0.05）； MVD与TGF-β1的表达之间存在正相关关系(r=0.70，P＜0.05)，MVD与nm23-H1的表达之间存在负相关关系(r=-0.62，P＜0.05)。结论 甲状腺乳头状癌中TGF-β1、nm23-H1和CD31表达水平可作为判断病情进展和肿瘤转移的指标之一。

【关键词】  甲状腺乳头状癌； TGF-β1； nm23-H1； MVD； 肿瘤转移

    Ａｂｓｔｒａｃｔ     Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ   To study the expressions of TGF-β1,nm23-H1,CD 31 in papillary thyroid cancer(PTC) tissues and its relation with the lymph node metastasis. Methods   TGF-β1,nm23-H1,CD31 were detected by EnVisionTM  immunohistoche- mistry method in 55 tumour tissues and 10 normal tissues; the expression of CD31 was used for the mark of the vascular endothelial cell, the tumor microvascular density(MVD) .Results   The positive expression rates of TGF-β1 and nm23-H1 in papillary thyroid cancer were 76.37％ and 65.46％, The expression levels of TGF-β1 and nm23-H1 in papillary thyroid cancer tissue were higher than that in normal throid tissue(χ2=16.64,10.61，P＜0.05). There was positive relationship between MVD and TGF-β1(r =0.70, P＜0.05). There was  negative relationship between MVD and nm23-H1(r =-0.62, P＜0.05) . Conclusions   TGF-β1, nm23-H1, and CD31  may be used to estimate the progression and lymph node metastasis.

    Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ    papillary thyroid cancer; TGF-β1; nm23-H1; MVD; tumor metastasis

    发甲状腺乳头状癌，其中有淋巴转移或远处转移者35例，无转移者20例。按UICC2002年TNM临床分期：Ⅰ期16例，Ⅱ期19例，Ⅲ期18例，Ⅳ期2例。对照组为10例正常甲状腺组织，取自甲状腺癌周围组织（简称癌周组织），经病理检查确认均无肿瘤。

    1.2　主要试剂和免疫组织化学方法　一抗为兔抗人TGF-β1多克隆抗体（SC-146，由美国Santa Cruz公司生产）、即用型兔抗人nm23-H1多克隆抗体和鼠抗人CD31蛋白单克隆抗体（JC70A，M082301，由德国Dako公司生产）；EnVisionTM试剂盒（由Dako公司生产）。

     所有标本经10％福尔马林固定,常规脱水透明、浸蜡、包埋，连续切片，切片厚4μm，用于EnVisionTM免疫组织化学法。石蜡切片常规脱蜡至水，微波修复抗原，3％H2O2溶液室温孵育20min，以消化内源性过氧化物酶，10％正常羊血清封闭30min，分别加一抗nm23-H1，湿盒中孵育，4℃过夜，滴加二抗，EnVisionTM试剂室温孵育1h。各步骤间均以0.01mol/L PBS缓冲溶液冲洗5min连续3次。DAB- H2O2显色，显微镜下控制时间，苏木素复染，脱水透明，中性树胶封片，Olympus BX-41显微镜观察、照相。用PBS缓冲溶液代替一抗作为阴性对照，以甲状腺乳头状癌癌周组织作对照组。

    1.3　结果判断　TGF-β1和nm23-H1免疫组化染色的阳性判定，细胞浆和部分细胞核着棕色颗粒者为阳性，不着色者为阴性。结果以显微镜下每张切片取5个高倍视野（200×，0.075mm2），计数阳性细胞所占比例，＜10％为阴性（－）；10％～25％为弱阳性（+）；26％～50％为中阳性（+ +）；＞50％为强阳性（+ + +）。弱阳性和中阳性为低表达，强阳性为高表达[2]。

     CD31结果判断及MVD：CD31的阳性表达产物主要分布于血管内皮细胞的胞质内，呈棕黄色或棕褐色染色。每张切片在脉管高密度区，随机选取5个高倍视野，分别计算每平方毫米阳性数，取平均值，作为该例肿瘤的MVD。

    1.4　统计学方法　采用SPSS 13.0统计学软件。计量资料采用均数±标准差（■）表示。计量资料两组间比较用t检验；计数资料两组间比较用χ2检验；MVD与TGF-β1、nm23-H1之间采用Spearmant等级相关分析检验。设P＜0.05为差异有统计学意义。

    2　结果

     甲状腺乳头状癌和癌周组织中TGF-β1、nm23-H1表达和MVD与临床病理指标的比较见表1。

    　　由表1可见：

    2.1 TGF-β1在甲状腺乳头状癌中的表达  TGF-β1阳性表达产物主要分布于细胞质内，部分也分布在细胞核，呈棕黄色颗粒染色，见封二图1。甲状腺乳头状癌中TGF-β1阳性表达率与癌周组织之间的差异有统计学意义(χ2=16.64，P＜0.05)。甲状腺乳头状癌TGF-β1在Ⅰ+Ⅱ期与Ⅲ+Ⅳ期阳性高表达率之间的差异有统计学意义（χ2=12.01，P＜0.05）；甲状腺乳头状癌TGF-β1阳性表达率在有无淋巴转移之间的差异也有明显差异（χ2=12.10，P＜0.05）；而在年龄和肿瘤大小的差异无统计学意义（P均>0.05）。

    2.2　nm23-H1在甲状腺乳头状癌中的表达　nm23-H1阳性表达产物主要分布于细胞质内，部分也分布在细胞核，呈棕黄色颗粒染色，见封二图2。本次研究的甲状腺癌与癌周组织中nm23-H1阳性表达率之间的差异有统计学意义（χ2=10.61，P＜0.05）。甲状腺乳头状癌nm23-H1阳性表达在临床分期中有明显差异，有统计学意义（χ2=5.82，P＜0.05）；甲状腺乳头状癌nm23-H1阳性表达率在无有淋巴转移之间的差异有统计学意义（χ2=12.13，P＜0.05）；而在年龄和肿瘤大小方面的差异无统计学意义（P均>0.05）。

    2.3　CD31在甲状腺癌组织和癌周组织中的表达  CD31阳性表达主要位于甲状腺癌周围间质的血管内皮细胞，见封二图3。癌组织的MVD明显高于癌旁组织，两者之间的差异有统计学意义（t=8.19，P＜0.05）。MVD表达在有无转移和临床分期中的差异均有统计学意义（t分别=6.21、6.17，P均＜0.05），而在年龄和肿瘤大小方面的差异无统计学意义（P均>0.05）。

    2.4　甲状腺癌组织中MVD与TGF-β1、nm23-H1表达的关系见表2。

     由表2可见，TGF-β1阳性表达的甲状腺乳头状癌组织中MVD值明显高于阴性者，差异有统计学意义（t=4.53，P＜0.05）。。根据统计学分析，TGF-β1表达与MVD之间存在着正相关(r=0.70, P＜0.05)。nm23-H1阴性表达的甲状腺乳头状癌组织中MVD值明显高于阳性者，两者比较差异有统计学意义（t=4.61，P＜0.0５）。根据统计学分析，nm23-H1表达与MVD之间存在着负相关(r =-0.62, P＜0.0５)。

    3　讨论

     TGF-β1为25kDa的二聚体多肽，主要在内皮细胞、血细胞、结缔组织细胞和上皮细胞中表达。目前认为，TGF-β1 促进肿瘤发生机制并非直接促进肿瘤细胞增殖,而是肿瘤细胞对TGF-β1 诱导的抑制信号失去敏感性,以及TGF-β1 抑制免疫反应,促进肿瘤基质生成等多种生物学作用的结果，是调节细胞增殖和分化的多功能细胞因子[3]。TGF-β1还可促使血管生成，它刺激周细胞、血管平滑肌细胞增生和分化，使血管样结构成为稳定的、成熟的血管床，导致肿瘤转移[4]。本次研究表明，TGF-β1蛋白在甲状腺乳头状癌组织中的表达显著高于癌周组织。TGF-β1表达有淋巴转移的高于无淋巴转移，TGF-β1阳性高表达率随着临床分期增高也增强。推测TGF-β1与甲状腺肿瘤的和转移有关，TGF-β1具有促进肿瘤血管生成作用的可能。

     nm23-H1作为肿瘤转移抑制基因，因其表达产物核苷二磷酸激酶，参与细胞的信号传递、微管组装，从而可特异性地抑制肿瘤转移[5]。随着肿瘤进展和淋巴道、血道转移的发生，肿瘤细胞抑癌蛋白的表达量减少，逐渐失去肿瘤细胞对生长、转移的抑制。本次研究结果显示，nm23-H1在甲状腺乳头状癌中的表达显著高于癌周组织，甲状腺乳头状癌中无淋巴转移者nm23-H1阳性表达率高于有淋巴转移者，临床分期中的Ⅰ+Ⅱ者nm23-H1阳性表达率高于Ⅲ+Ⅳ者。表明nm23-H1表达阴性者，肿瘤转移性强，预后差；nm23-H1表达阳性者肿瘤转移性弱，预后好。

     血管的生成可以直接影响肿瘤细胞的淋巴结转移[6]。CD31在血管和淋巴管内皮细胞均有表达，是内皮细胞标记物，它参与血管生成，并与肿瘤转移有关[7]。因此，作为血管内皮细胞的标记物，直接反映了甲状腺乳头状癌微血管的生成情况。统计学结果显示，甲状腺乳头状癌组织中MVD与TGF-β1表达之间存在正相关性，说明TGF-β1表达越高，MVD在一定程度上也越增加，提示TGF-β1可能在一定程度上促进甲状腺癌肿瘤微血管形成，在肿瘤转移中起重要的作用。而甲状腺乳头状癌组织中MVD与nm23-H1表达之间存在负相关性，说明nm23-H1表达越高，MVD在一定程度上也越少，提示nm23-H1在抑制肿瘤转移中起重要的作用。

     综上所述，甲状腺乳头状癌TGF-β1、nm23-H1和CD31的表达与甲状腺乳头状癌的转移及病理分期相关，TGF-β1表达逐渐增强，nm23-H1表达逐渐减弱，CD31和MVD逐渐增高，是甲状腺乳头状癌病情进展和肿瘤转移的重要信号，提示甲状腺乳头状癌中TGF-β1、nm23-H1和CD31表达水平可作为判断病情进展和肿瘤转移的指标之一。

【】
  １ gregory W. Randolph saunders, surgery of the thyroid & para- thyroid glands[M]. elsecier science(U.S.A). 2003, 194.

2 Kojc N, Zidar N, Vodopivec B, et al. Expression of CD34, alphasmooth muscle actin, and transforming growth factor beta1 in squamous intraepithelial lesions and squamous cell carcinoma of the larynx and hypopharynx[J]. Hum Pathol.2005, 36(1):16-21.

3 Shariat SF, Kim JH, Andrews B, et al.Preoperative plasma levels of transforming growth factor beta 1 strongly predict clinical outcome in patients with bladder carcinoma[J].Can- cer, 2001, 92 (12) : 2985- 2992.

4 丁国芳, 徐银峰, 杨最素, 等. TGF-β1在前列腺癌中的表达及其与生存率关系的研究[J]. 浙江医学, 2007, 28（9）： 709-711.

5 Valentijn L, Koster J, Versteeg R. Read-through transcript from NM23-H1 into the neighboring NM23-H2 gene enco- des a novel protein, NM23-LV[J]. Genomics, 2006, 87 (4): 483-489.

6 傅玉峰, 丁炯. VEGF的表达与胃癌生物学特性的实验研究[J]. 南京医科大学学报（版）, 2006, 9, 26(9): 749-752.

7 Jacquemier J, Mathoulin-Portier MP, Valtola R, et al.Pro-gnosis of breast carcinoma lymphangio-genesis evaluated by immunohistochemicnal investigation of vascular-endothelial- growth-factor receptor 3[J]. Int J Cancer, 2000, 89(1):69-73.