高丽参水溶性多糖GPⅢ的分离纯化及组成研究

【摘要】  目的：从高丽参中提取出水溶性粗多糖GP，经分离纯化，得到均一多糖GPⅢ，研究其组成等性质。方法:粗多糖经Sevage法脱蛋白，DEAE Sepharose CL?6B柱层析分离纯化得到GPⅢ，经HPLC和醋酸纤维素薄膜电泳法检验其均一性。结果：GPⅢ是均一组分多糖，GC分析它的单糖组成是葡萄糖。结论：GPⅢ是均一组分多糖，GC分析单糖组成是葡萄糖，方法准确。

【关键词】  高丽参 分离 纯化 组成

　　高丽参为五加科植物人参Panax  ginseng C.   A.   Mey的干燥根。主产于我国东北地区,朝鲜和日本，俗称别直参［1］。本文对高丽参粗多糖进行分离纯化，并对它的组成成分等性质进行了研究。

　　1     材料、试剂与仪器

　　1.   1     材料     高丽参:购于辽宁丹东。

　　1.   2     试剂与仪器     单糖标准品为Sigma公司试剂；DEAE?sepharose  CL?6B凝胶为Pharmacia公司产品；其他试剂均为上海化学试剂有限公司分析纯。MC99?2自动核酸蛋白分离层析仪，上海沪西分析仪器厂；高效液相色谱，安捷伦HP1100；气相色谱仪，安捷伦6890N。

　　2     实验方法

　　2.   1     高丽参粗多糖的提取     准确称取高丽参250 g，加入一定体积80%乙醇，在50℃水浴中回流提取6 h，离心得提取液。残渣烘干后，取50 g加入3000 mL的蒸馏水，在80℃恒温水浴下提取2 h，过滤，滤液在60℃下减压旋转蒸发浓缩，离心，上清液加入4倍体积无水乙醇进行醇沉，放置4℃冰箱中过夜。次日离心10 min(3000 r/min)，取沉淀，常规干燥得粗多糖GP。

　　2.   2     粗多糖的分离与纯化［2?3］

　　2.   2.   1     脱蛋白     3%糖溶液，按木瓜蛋白酶：蛋白质?1：50取蛋白酶，加入糖溶液中，将糖液装入透析袋，37℃，保温24 h，加少量二甲苯防腐。按糖液总体积1/4加入Sevage试剂(氯仿:正丁醇＝4:1)，充分振荡2～3 h，静止，离心，取上清重复，至无游离蛋白为止。

　　2.   2.   2     粗多糖的DEAE?Sepharose CL?6B柱层析制备     500 mg经脱蛋白后得GP溶于10 mL蒸馏水,先后用蒸馏水和0?1M NaCl进行洗脱，流速调为40 mL/h，1管/12 min，自动部分收集器收集。用苯酚?硫酸法测定糖的分布情况，按各个波峰范围部分收集洗脱液，由分离层析仪中的UV?160A紫外光谱于280 nm下同步检测蛋白质。

　　2.   3     多糖样品纯度鉴定方法［4］     多糖样品的纯度鉴定采用高效液相色谱法和醋酸纤维素薄膜电泳法。高效液相色谱柱为SUGAR KS?804，水作流动相，流速1 mL/min，柱温50℃，示差检测器检测。

　　2.   4     红外光谱分析     取2 mg糖样，KBr亚片，红外光谱分析。

　　2.   5     糖组成分析［4?6］     10 mg的糖样溶于10 mL  2M三氟乙酸120℃水解6 h，水解产物用无水乙醇蒸除三氟乙酸至中性，干燥产物进行衍生物的制备(硅烷化)。气相色谱柱是HP?5毛细管柱(30 m×0.   32 mm,0.   25 μm)，柱温采用程序升温即160℃ 20℃/ min 180℃ 10℃/min 220℃(2 min)，检测器和进样口温度均是230℃。

　　2.   6     分子量测定［4］     取标准样品(T?10、T?40、T?70、T?500、蓝色葡聚糖、葡萄糖)及待测样品溶于去离子水中，用0.   4 μ纤维素膜过滤，进样，测出各自的保留时间。根据各标准品的保留时间,按公式Kav?(Ve?Vo)/(Vt?Vo)求出对应的Kav, 以LogMw对Kav作图得标准曲线。同样测出样品的保留时间,求出其Kav从标准曲线上即可求出其分子量。

　　3     结果与分析

　　3.   1     粗多糖的提取与分离纯化     高丽参经水提取,粗多糖GP得率为28.   05%。GP经脱蛋白后，上DEAE?Sepharose CL?6B柱层析制备，按0?1M NaCl制定洗脱曲线，GP的NaCl梯度洗脱液经苯酚?硫酸检测只含有一个糖洗脱峰，紫外检测仪在280nm下也检测到1个蛋白质洗脱峰，并且与糖洗脱曲线相吻合，推测此糖组分可能含有结合蛋白质，收集42～60管洗脱液，透析，浓缩，醇沉，沉淀常规干燥命名为GPⅢ。

　　3.   2     GPⅢ的纯度鉴定     配制0.   1%的样品液，0.   4 μ纤维素膜过滤，进样量20 μL。GPⅢ的高效液相色谱结果检测出一条峰，证明GPⅢ是纯度较好的样品。GPⅢ在醋酸纤维素薄膜电泳上也跑出来一条区带，再次验证GPⅢ为成分单一的一种多糖。

　　3.   3     GPⅢ的分子量鉴定     GPⅢ的保留时间分别是6.   085,查标准曲线，得GPⅢ的分子量分别在40万左右。

　　3.   4     GPⅢ的性质分析     红外光谱分析表明，GPⅢ在3 600～3 200 cm有?OH吸收峰,在2 923 cm左右有一强吸收峰,为?CH、?CH2共振吸收峰,在1 635 cm左右有多糖的水合振动峰。GPⅢ经酸水解，衍生化后的气相色谱结果(图略)，对照标准单糖的气相色谱图，中间峰代表内标甘露醇，得出GPⅢ由葡萄糖组成。

　　4     结论
       
　　高丽参经水煮提取后得粗多糖GP。GP经脱蛋白和DEAE Sepharose CL?6B柱层析分离纯化,在NaCl梯度洗脱后得到一个组分GPⅢ，通过高效液相色谱和醋酸纤维素薄膜电泳鉴定，该组分是纯度较好的样品。分子量研究表明GPⅢ的分子量分别是40万左右。经红外光谱鉴定GPⅢ有多糖的特征吸收峰，气相色谱研究表明，GPⅢ主要由葡萄糖构成［5］。

【】
  　［1］李春平,欧春燕,邱专财.高丽参与伪品的鉴别要点［J］.海峡药学,2003,15(5):79?82.

　　［2］陈凤清,陈智博,温得中,等.长白山松杉树芝子实体水溶性粗多糖的纯化及结构初探［J］.吉林中医药,2005,25(12):53?54.

　　［3］邢文善,纪耀华,张彦形,等.半枝莲粗多糖的提取及总糖的含量测定［J］.吉林中医药,2005,25(7):56.

　　［4］Zhaojing Wang,dianhui Luo.Antioxidant activities of different fractions of polysaccharide purified from Gynostemma pentaphyllum Makino［J］.Carbohydrate Polymers,2007,(68):54?58.

　　［5］王昭晶,罗巅辉.穿山龙多糖的提取,纯化与抗氧化活性研究()［J］.天然产物研究与开发,2007,19(1):29?34.