真菌2572的抗白细胞介素6受体活性成分研究

                  作者：邹迎曙 张洋 姜蓉 李元 吴剑波
【摘要】  目的 从真菌2572的代谢产物中分离白细胞介素6受体(IL-6R)拮抗剂。方法 利用多种色谱技术对活性部位进行分离纯化，并根据MS、NMR等光谱方法对化合物的结构进行了鉴定。结果 从真菌2572代谢产物活性部位中得到两个化合物2572A和2572B。结论 2572A已知为6-epi-5′-hydroxymycosporulone，有IL-6R拮抗活性，2572B为核黄素，活性较弱。 
【关键词】  白细胞介素6受体拮抗剂； 6-epi-5′-hydroxymycosporulone； 核黄素； 结构研究
    ABSTRACT  Objective  To isolate IL-6R antagonists from the cultured broth of the fungus 2572. Methods  The compounds were separated by multi-chromatography and their chemical structures were elucidated by spectral analysis.  Results  Two known compounds, 2572A and 2572B were purified from the fermented extracts.  Conclusions   2572A and 2572B were identified to be 6-epi-5′-hydroxymycosporulone and riboflavin, respectively. And 2572A shows IL-6Ra activity whereas 2572A has weak activity.
    KEY WORDS  Human interleukin 6 receptor antagonist;  6-epi-5′-hydroxymycosporulone;  Riboflavin; Structure identification
     白细胞介素6(IL-6)是一种功能广泛的细胞因子，它的生物学功能十分复杂，并在多种疾病如风湿性关节炎、Castleman′s病、多发性骨髓瘤等症中扮演重要角色［1］。IL-6通过形成IL-6/IL-6R/gp130六聚体复合物后，方可进行信号的传导，发挥其生物学活性，而白细胞介素6受体(IL-6R)是介导这个六聚体复合物形成的重要中介分子［2］。本实验选用以基因重组白细胞介素可溶性受体(sIL-6R)为靶位的IL-6R高通量筛选模型，从真菌2572的代谢产物中分离得到了两个化合物2572A和2572B，本文报道了这两个结构和IL-6R拮抗活性研究。
    1  实验材料
    1.1  菌株与培养基
    2572菌种来自本所菌种筛选中心。    种子和发酵培养基：甘油1%，葡萄糖2%，蔗糖1%，黄豆饼粉0.2%，蛋白胨(F403)1%，聚乙二醇(6000)0.25%，KH2PO4 0.03%，NaNO3 0.3%，(NH4)2SO4 0.3%，pH6.0。
    1.2  仪器与试剂
    酶标比色计(Biorad)，X5型大孔吸附树脂(天津南开大学化工厂)，ODS/C18柱色谱介质(日本Shimadzu公司)，Sephadex LH-20(上海化学试剂厂)，Sephadex G-10(Solarbio)，质谱仪(AccuTof CSLCMS)，核磁共振仪(Bruker AM-400)，所有化学试剂均为市售分析纯试剂，高效液相色谱仪(Shimadzu LC-10Avp)，柱型号为Inertsil ODS-2(4.6mm×150mm)，HPLC检测条件：流动相为30%乙腈∶水，检测波长215nm，柱温25℃。
    2  方法与结果
    2.1  发酵
    斜面(YM培养基)26℃培养7d，接种于100ml种子培养基中(500ml培养瓶)，26℃振荡(250r/min)培养48h，以2%转种至发酵培养基，26℃振荡培养96h，发酵液pH6.0。
    2.2  提取分离与纯度鉴定
    将12L发酵液过滤，滤液通过X5型大孔树脂，弃去流出液，分别用30%、50%和80%丙酮洗脱，测活性发现活性部位主要集中于30%丙酮洗脱液中；收集30%洗脱液并挥去丙酮，用乙酸乙酯萃取；将乙酸乙酯部分用少量甲醇溶解，上样于Sephadex LH-20柱，50%甲醇洗脱，HPLC检测，按峰收集，得白色粗品A；将粗品A以少量甲醇溶解，上样于ODS/C18反相柱，以40%甲醇∶水系统洗脱，得一白色纯品2572A，冻干后为50mg，HPLC检测2572A保留时间为11.72 min；将萃取后的水部分冷干上Sephadex G-10柱，水洗脱，收集后端黄色段成分，冷干后再上ODS/C18反相柱，10%甲醇∶水(0.05%TFA)系统洗脱，得黄色纯品2572B，冻干后8mg，HPLC检测其保留时间为6.95min。
    2.3  理化性质及结构鉴别
    2572A为白色无定形粉末，易溶于甲醇。其ESI-MS(positive)示：m/z 225［M+H］+，247［M+Na］+，分子量为224。又由HRMS：m/z 225.0769［M+H］+(Calcd.225.0763)确定分子式为C11H12O5。
    根据13C-NMR谱及DEPT谱(表1)可知，该化合物有4个季碳(δ197.2， 171.9， 158.6和59.9)， 5个表1        2572A的1H-NMR及13C-NMR数据 -： 碳谱及氢谱上均无显示。CH(δ150.8，124.7，71.7，67.8和32.8)，1个CH2(δ86.2)，1个CH3(δ14.9)。1H-NMR谱中有2个低场的CH(δ6.62和6.05)互相偶合，偶合常数10.2Hz，说明分子中存在一对顺势偶合的烯碳。根据HMQC确定了与H直接所连的各个C的化学位移(表2)。HMBC谱中可观察到下列相关信号：H-7与C-1，C-5，C-6；H-5与C-1，C-3，C-6；H-2与C-1，C-3，C-2′；H-与6C-2′以及H-6′与C-4′，C-5′；根据以上信号，可获得2572A的平面结构。通过NOE谱，照射H-2(δ4.32)时，H-6(δ3.35)和H-5′(δ5.32)出现信号增强，说明H-2，H-6和H-5′ 三个氢原子空间位置接近，确定了该化合物的相对构型。通过与［3］相对照确认该化合物为6-epi-5′-hydroxymycosporulone，其结构见图1。
    2572B为黄色无定形粉末，ESI-MS(positive)显示该化合物准分子离子峰为377［M+H］+。13C-NMR和DEPT谱包括17个碳的信号，其中8个季碳(全都 表22572B的1H-NMR及13C-NMR数据位于低场)，5个CH，2个CH2，2个CH3。其中δ110～170有10个不饱和碳信号，说明可能存在芳香基团；δ40～80区域有5个碳信号，结合1H-NMR谱中δ3.0～5.0的含7个氢的多重峰信号，推测分子中可能含有一个糖基。经查阅化合物数据库(Spectral Database for Organic Compounds, SDB, http://www.aist.go.jp/RIODB/SDB S/cgi-bin/cliretc-frame top.cgi? lang=eng)和文献［4］，2572B的1H-NMR和13C-NMR数据与核黄素基本一致，因此确定其为同一个化合物，分子式为C17H20N4O6，结构见图2。本文还根据其HMQC和HMBC数据对其碳、氢信号进行了归属，结果见表2。
    图2    2572B的结构图
    2.4  白介素6受体(IL-6R)拮抗活性检测方法
    重组人IL-6(溶于pH7.2，PBS缓冲液，1μg/ml)以每孔100μl加至96孔酶标板，4℃放置过夜；吸出后每孔加入250μl 3%小牛血清的PBS缓冲液(KH2PO4 0.024%，Na2HPO4 0.363%，KCl 0.02%，NaCl 0.8%，pH7.4)，4℃放置8h；再以PBS洗板5次；待测样品溶于含1% BSA的PBS溶液，每孔加入样品50μl和重组IL-6R(1∶1000)50μl，4℃放置过夜；以PBST(含0.1% Tween 20的PBS)洗涤5次；每孔加入小鼠抗人IL-6R抗体(R&D systems，1∶1000)100μl，4℃放置1h；以PBST洗板5次；每孔加入辣根过氧化物酶标记的马抗小鼠IgG抗体(1∶5000)100μl，4℃放置1h；以PBST再洗板5次后，每孔加入底物TMB(3，3′，5，5′-tetramethyl benzidine dihydrochloridide)及过氧化氢溶液各100μl，室温放置30～60min，每孔加入2mol/L盐酸100μl以终止显色，采用酶标比色计于450nm测定A值， 试验中设定空白对照(TMB)和样品对照(表3)，结果显示2572A活性较好，且随浓度降低其活性也降低；2572B的活性则较低。
    3  讨论
    6-epi-5′-hydroxymycosporulone(2572A)是1997年从真菌Microsphaeropsis sp. F-5050中分离出来的一种螺环类成分，它对人白血病细胞(HL-60)的细胞粘附功能(cell adhesion)有一定抑制作用，但对HL-60和黑素瘤细胞B16/BL6的细胞生长功能的抑制活性一般［3］。真菌2572是经过IL-6R拮抗剂筛选模型检测筛选出的活性菌株之一，2572A在真菌2572发酵液中含量较高，也表现出了较好的IL-6R拮抗活性。鉴于IL-6R在骨髓瘤细胞中的高丰度分布，因此还需要对该化合物是否有抑制骨髓瘤细胞作用做进一步的研究。核黄素(2572B)是机体中的必需微量成分，生物功能广泛［５］，但本研究未发现它在IL-6R拮抗方面有较好的活性。表3产物浓度与IL-6R活性关系(拮抗率，%)
 
【文献】
  ［1］ Gentiletti J, Fava R A. Does vascular endothelial growth factor play a role in interleukin-6 receptor antagonist therapy for rheumatoid arthritis ［J］. Arthritis Rheum,2003,48(6):1471～1474.

［2］Varghese J N, Moritz R L, Lou M Z, et al. Structure of the extracellular domains of the human interleukin-6 receptor α-chain ［J］. Proc Natl Acad Sci USA,2002,99(25):15959～15964.

［3］Akiko F, Yosuke T, Tomonori N, et al. New members of the macrophelides from Microsphaeropsis sp. Fo-5050 IV ［J］. J Antibiot,1999,52:501～504.

［4］ 李锋，何直 ，叶阳. 红花中核黄素及其降解产物［J］. 中草药，2004，35(3)：247～249.

［5］ 项昭保，戴传云，朱蠡庆. 核黄素生理生化特性及其功能［J］. 食品研究与开发，2004，25(6)：9～95.