临床分离鲍曼不动杆菌耐药基因abeM的研究

                          作者：苏显中 房婷 沈峰 户登

【摘要】  目的 探讨临床分离鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii，Ab)耐药的分子机制。方法 以临床分离的Ab 35、Ab 36染色体DNA为模板扩增abeM基因，对abeM基因扩增产物进行DNA测序及同源性分析；将abeM基因扩增产物与载体连接后转化入大肠埃希菌KAM32感受态细胞中，对转化子进行药敏分析。结果 Ab 35和Ab 36的abeM基因扩增产物与已报道的abeM基因核苷酸序列同源性分别达99%和98%，Ab 35的abeM结构基因推导的氨基酸序列发生了3个氨基酸残基变异，Ab 36的2个氨基酸残基发生了变异；含有Ab 36的abeM基因的转化子具有更广和更强的耐药图谱；两种转化子的耐药性均能被药物外排泵抑制剂CCCP和维拉帕米逆转。结论 鲍曼不动杆菌药物外排蛋白AbeM中氨基酸残基Val 52、Gln 203及Ser 256对多重耐药强度具有重要作用，药物外排泵抑制剂可有效抑制AbeM蛋白的耐药活性。

【关键词】  多重耐药； 基因克隆； 鲍曼不动杆菌

    ABSTRACT  Objective  To investigate the molecular mechanism of drug?resistance in Acinetobacter baumannii (Ab) clinical isolates.  Methods  PCR amplification of drug resistance gene abeM was carried out using chromosomal DNA of Ab 35 and Ab 36 clinical isolates as template. PCR product of abeM gene was sequenced. The nucleotide sequences and deduced amino acid sequences were analyzed by BLAST of NCBI. After cells of Escherichia coli KAM32 transformed with a plasmid carrying the abeM gene PCR product, MICs of various drugs were determined by serial two?fold dilution method.  Results  PCR product of Ab 35 or Ab 36 shared 99% and 98% identities with the gene abeM in Ab ATCC19606 which had been reported, respectively; three amino acid residues mutated in deduced amino acid sequences of abeM structure gene from Ab 35, two residues mutated in deduced amino acid sequences of abeM structure gene from Ab 36; the drug resistance was wider and stronger for the transformants carrying abeM gene of Ab 36; the drug resistance of two kinds of transformants could be reversed by CCCP and verapamil, two drug efflux pump inhibitors.  Conclusion  The amino acid residues Val 52, Gln 203 and Ser 256 of AbeM played the important roles in the intensity of multiple resistance; the drug efflux pump inhibitors CCCP and verapamil could effectively inhibited the drug resistance of AbeM.

    KEY WORDS  Multiple resistance;  Gene cloning;  Acinetobacter baumannii

    鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii，Ab)是一种好氧的非发酵类革兰阴性杆菌。由于能够引起诸如肺炎、泌尿器官感染、心内膜炎、伤口感染、脑膜炎及败血病等，Ab已成为ICU的重要致病菌［1］。近年来Ab在世界范围内逐渐呈现多重耐药趋势，2004年9月据我国地区报道一种超强细菌“泛耐药性鲍曼不动杆菌”在台湾多家蔓延，其对处方药物普遍存在抗性，患者的病死率高达60%［2］。我们在Ab ATCC19606的染色体DNA上已克隆出了abeM多药外排基因，其编译的多药外排泵AbeM受质子电化学势驱动，能够将许多结构与功能不同的药物主动排到细胞之外［3］。本文对两株临床分离鲍曼不动杆菌的abeM基因进行了克隆，并分析了多药外排泵AbeM的氨基酸变异对其基质特异性的影响。

    1  材料与方法

    1.1  菌株与质粒

    临床分离菌株Ab 35与Ab 36由应春妹副教授惠赠；药物超感受性菌株Escherichia coli KAM32(主要药物外排基因acrB、ydhE已被破坏)［3］以及质粒pUC19均为本实验室保藏。细菌37℃有氧条件下培养在LB培养液中，其生长由测定650nm处光学密度进行监控。

    1.2  药敏分析

    卡那霉素(kanamycin)、链霉素(streptomycin)、氯霉素(chloramphenicol)、四环素(tetracycline)、红霉素(erythromycin)、诺氟沙星(norfloxacin)、溴化乙锭(ethidium bromide)、罗丹明6G(rhodamine 6G)、脱氧胆酸钠(dexoycholic acid salt，DC)、十二烷基硫酸钠(dodecyl sodium sulfate，SDS)等各种药物的最小抑制浓度(MIC)采用液体二倍稀释法在含有不同药物浓度的MHB培养基中进行测试［3］。细菌细胞在37℃培养24h后测试MIC值，每种药物MIC值取细菌细胞不能生长的最低药物浓度。在进行药物外排泵抑制剂测试时，药物外排泵抑制剂羰基氰氯苯腙(CCCP)和维拉帕米(verapamil)的终浓度分别为1和100μg/ml。

    1.3  分子操作

    Ab 35和Ab 36的染色体DNA采用Chen等的方法［4］制备。根据已知药物外排基因abeM的序列(注册号AB204810)，利用软件Oligo 6.0和Primer 3设计引物，其引物序列为：5′?GTGAATTCGGGCAAT?TGGTCATTTCTATGT?3′，5′?TCGAATTCGAAAGAGCATCAGTTCAATGTGG?3′。95℃变性5min后，95℃ 30s，55℃ 1min，72℃ 2min，30个循环，72℃延伸5min。PCR仪为美国MJ Research公司，PTC?100，引物合成和PCR反应试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司(TaKaRa)公司。

    PCR产物用PCR产物回收试剂盒(DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0，TaKaRa)回收，其与质粒pUC19分别经EcoR I酶切，连接后转化到E.coli KAM32感受态细胞中，重组质粒分别命名为pABS35和pABS36。

    1.4  扩增产物的序列测定及同源性分析

    将PCR产物纯化后送大连宝生物工程有限公司进行DNA测序，测序结果在GenBank上用BLAST进行同源性检索分析。

    2  结果

    2.1  PCR扩增检测abeM药物外排基因

    以Ab 35和Ab 36染色体DNA为模板，用设计的基因引物进行PCR扩增，均获得一条约1.84kb的阳性扩增条带(图1)。将产物与经过处理的载体pUC19分别连接后获得重组质粒pABS35和pABS36。

    2.2  扩增产物的DNA序列分析

    将重组质粒pABS35和pABS36测序，获得的abeM基因序列分别在GenBank中进行BLAST检索，发现它们与Ab ATCC19606 abeM基因的核苷酸序列高度同源。来源于Ab 35 abeM结构基因的核苷酸序列与Ab ATCC19606的有99%同源性，推导的氨基酸序列发生了3个氨基酸残基的变异，Val 52→Glu，Gln 203→Lys，Ser 256→Gly；来源Ab 36 abeM结构基因的核苷酸序列与Ab ATCC19606的有98%的同源性，2个氨基酸残基发生了变异，Ser 233→Asn，Lys 308→Glu。启动子序列没有发生任何变化。

    2.3  重组子的药敏分析

    将重组质粒pABS35和pABS36分别转化入E.coli KAM32感受态细胞中，其药物MIC值见表1。

    M：核酸分子量标准品

    1：Ab 35中的扩增产物；  2：Ab 36中的扩增产物

    图1    abeM基因的PCR扩增产物电泳图谱  表1 转化子对各种药物的敏感性含有pABS35的E.coli KAM32对链霉素、溴化乙锭、罗丹明6G及脱氧胆酸钠耐药(相对耐药性大于或等于4倍)，含有pABS36的E.coli KAM32对链霉素、诺氟沙星、溴化乙锭、罗丹明6G、脱氧胆酸钠及十二烷基硫酸钠具有很明显的抗性。总之，含有pABS36的E.coli KAM32比含有pABS35的E.coli KAM32具有更广和更强的药物抗性图谱。

    2.4  药物外排泵抑制剂对重组子耐药性的影响

    加入药物外排泵抑制剂CCCP和维拉帕米，调查它们对转化子有抗性药物的MIC值的影响。经测试发现，含有pABS35的E.coli KAM32对链霉素与溴化乙锭的耐药性在抑制剂作用下得到了控制(MIC降至原值的1/4)；含有pABS36的E.coli KAM32的耐药性，除了对十二烷基硫酸钠的耐药性没有得到抑制外，其余药物的MIC值都降至原值的1/4以下，并且CCCP的作用强于维拉帕米(表2)。

    3  讨论

    关于鲍曼不动杆菌的耐药机制研究，目前发现使药物降解或因gyrA和parC基因突变以及药物的修饰与酶学失活都可以导致药物抗性［5，6］，细菌外膜蛋白表2 加入外排泵抑制剂的转化子对各种药物的敏感性(OMPs)表达减少也被证明是与有些药物抗性相关的［7］，多药外排泵介导多重耐性也已见报道［3，8，9］，再加上其可以形成生物被膜［10］，如此多种耐药机制使得鲍曼不动杆菌耐药问题日渐复杂，临床分离出的多重耐药菌株日渐增多，为临床带来了新的难题。

    AbeM是一个组成性、质子介导的MATE家族多药外排泵，在鲍曼不动杆菌多重耐药中发挥着重要作用［3］。通过对基因abeM进行克隆及测序分析，结合表1的结果发现，尽管Ab 36相对Ab 35的abeM结构基因核苷酸出现更多的变异，但因多为同义突变，推导的氨基酸序列中Ser233→Asn与Lys 308→Glu的变异对AbeM的药物外排作用并没有产生明显的影响(与来自Ab ATCC19606的AbeM基质特异性比较，数据未列出)；从Ab 35的abeM结构基因核苷酸序列推导出的氨基酸序列中，Val 52→Glu，Gln 203→Lys，Ser 256→Gly的变异明显降低了AbeM对诺氟沙星与溴化乙锭的外排作用，说明Val 52、Gln 203与Ser 256可能是以某种组合方式参与了上述两种药物的外排；另外，这3个氨基酸残基的变异在具有不同基质特异性的Ab 35和Ab 36(数据未列出)当中是否发挥着作用也有待进一步的研究。

    CCCP与维拉帕米均为药物外排泵的抑制剂，可直接或间接去除细胞膜质子电化学势而阻遏外排泵对药物的外排。表2结果表明这两种抑制剂可明显降低AbeM对药物的外排作用(十二烷基硫酸钠除外)，即可以增强药物在胞内的蓄积，实现药物杀菌的效果，这与我们以前研究Ab ATCC19606的结果一致。由于测试时使用的抑制剂浓度对人体可能会产生负面影响，从中药材或其它天然物质中提取、筛选对人体无毒无害的高效外排泵抑制剂将是治疗该菌引起感染的一个可行的方向。

【】
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