促发和加速HPV6.11/16.18感染相关因素研究
作者：李桂军 姚霞瑾 周建娟
【摘要】 目的 探讨pH值、清洁度、白细胞、脓细胞、霉菌、滴虫、线索细胞等因素中，与HPV6.11/16.18感染和加速感染进程的相关因素。方法 分别采用Asmel法和荧光定量PCR方法，对205例疑似尖锐湿疣感染患者的宫颈分泌物进行pH值、清洁度、白细胞、脓细胞、霉菌、滴虫、线索细胞、过氧化氢(H2O2)浓度、唾液酸苷酶活性、白细胞酯酶测定和HPV6.11/HPV16.18 DNA浓度测定，利用统计学方法对结果进行与HPV6.11/16.18感染和加速感染进程的相关因素的筛选。结果 205例疑似尖锐湿疣感染患者检出HPV6.11、HPV16.18、HPV6.11/16.18阳性例数为52、45、26。Logistic回归和多因素方差分析结果表明，清洁度和H2O2浓度与HPV6.11/16.18感染和加速感染进程密切相关，与脓细胞、霉菌、唾液酸苷酶并无相关性。pH值、白细胞、霉菌、滴虫、线索细胞、白细胞酯酶与HPV6.11/16.18感染虽无相关性，但在引起HPV6.11/16.18感染方面起到重要作用。结论 HPV6.11/16.18感染在急慢性宫颈炎患者中普遍存在。生殖道清洁度和微生态变化与HPV6.11/16.18感染和感染进程变化密切相关。
【关键词】 人乳头状瘤病毒 宫颈炎 荧光定量PCR
【Abstract】Objective To study the correlating factors which promote HPV6.11/16.18 infection , such as pH，clearing degree, leukocyte, pyocyte, mycetes, infusorian, clue cell et al. Methods The cervix secretions from 205 patients suspected of condyloma were collected and the above factors as well as neuraminidase's activity、H2O2、neuraminidase's activity、leucocyte esterase and HPV6.11/HPV16.18 DNA were tested by Asmel and fluorescent quantitation PCR. Statistics were used to analyze the correlation between the factors and HPV6.11/16.18 infection and infection process. Results The positive rate of HPV6.11,HPV16.18,HPV6.11/16.18 were 52（25.4%）、45（22.0%）、26（12.7%） respectivelys. Logistic regression analysis and multiple factor variance analysis showed clearing degree and H2O2 concentration promoted HPV6.11/16.18 infection and speeded infection process. But pyocyte, mycetes, neuraminidase had no dependability with HPV6.11/16.18 infection. Conclusion HPV6.11/16.18 infection exists in acute or chronic cervicitis patient generally. The change of genital tract clearing degree and microecology are correlated closely with HPV6.11/16.18 infection and infection process.
【Key words】Human papilloma virus Cervicitis Fluorescent quantitation PCR
人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)作为一种双链小DNA病毒，其感染与宫颈癌的发生密切相关［１］。研究表明，HPV16.18作为高危型HPV病毒，和一些较重癌前病变及侵袭性癌有关，而HPV6.11作为低危型HPV病毒，和尖锐湿疣及较轻癌前病变相关［２］。Swan等通过研究认为，当HPV拷贝数≥105，宫颈上皮细胞就易发生各种癌前病变［３］。现大量研究显示，HPV感染患者相当一部分合并宫颈炎［４］。宫颈炎作为宫颈癌的发生、发展中危险因素之一，是妇科最常见的疾病之一。作者自2007年6月至2008年6月通过对生殖道及其上皮细胞的pH值、清洁度、白细胞、脓细胞、霉菌、滴虫、线索细胞及H2O2、唾液酸苷酶、白细胞酯酶等因素与HPV感染的相关性及加速HPV感染进程的相关因素进行研究，为进一步研究HPV致肿瘤机制及宫颈癌的防治打下基础。
1 临床资料
1.1 一般资料
本组疑似尖锐湿疣感染205例，年龄25～45岁；其宫颈分泌物进行Asmel、H2O2浓度、唾液酸苷酶活性、白细胞酯酶和HPV6.11/HPV16.18 DNA浓度的测定。
1.2 主要试剂和仪器
HPV6.11、HPV16.18 DNA检测试剂盒购于广州达安基因工程有限公司。H2O2浓度测定、唾液酸苷酶活性测定、白细胞酯酶测定JY-Po-Color BV Set 试剂盒购于北京中生金域诊断技术有限公司。荧光定量PCR利用ABI PRISM 7000型PCR仪。
1.3 研究方法
(1)宫颈分泌物Asmel检查：用三只一次性无菌棉试子在宫颈颈口内2cm左右处顺时针旋转3圈，收集宫颈表面分泌物及脱落细胞。将其中一只棉试子加1ml生理盐水混匀后，检查其pH值、清洁度、白细胞、脓细胞、霉菌、滴虫、线索细胞和胺试验等。(2)H2O2浓度、唾液酸苷酶活性和白细胞酯酶测定：取另一支棉试子加缓冲液400μl，反复挤压，使样品溢出。检测严格按JY-Po-Color BV Set 试剂盒说明书进行。(3)HPV6.11、HPV16.18 DNA提取：取第三支棉试子加入灭菌生理菌水1ml，充分振荡，使样品溢出。移至1.5ml EP管中，12 000 rpm 离心13min，吸弃上清液，再加灭菌生理菌水1ml离心弃上清液后，沉淀加50μl DNA提取液充分振荡混匀，100℃水浴10min，至4℃过夜。12 000 rpm 离心8min，置-20℃备用。HPV6.11、HPV16.18 DNA检测按试剂盒说明书进行。
1.4 统计学分析
采用SPSS 10.0软件进行数据处理和统计。
2 结果
2.1 统计
205例分泌物标本中，检出HPV6.11、HPV16.18、HPV6.11/16.18阳性分别为52例、45例和26例，检出率分别为25.4%、22.0%和12.7%。在统计过程中，按DNA拷贝数103～105、106～107、>107人为将感染情况分成三级。pH值分>4.5和<4.5，清洁度分≤Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，白细胞按少量、1+、2+、3+进行分层统计。脓细胞、霉菌、滴虫和线索细胞按镜下可见和未见分层统计，其中线索细胞以胺试验进行确认。H2O2 按<2μmol/l为阳性、>2μmol/l为阴性分层统计。唾液酸苷酶、白细胞酯酶按实验阳性、阴性分层统计。见表1。表1 HPV6.11、HPV16.18、HPV6.11/16.18阳性和阴性样本统计分析（略）
2.2 相关性分析
(1)HPV6.11、HPV16.18、HPV6.11/16.18相关因素的logistic回归分析：分析过程中，将HPV6.11、HPV16.18、HPV6.11/16.18 DNA拷贝数>103定义为1， DNA拷贝数低于检测线定义为0； pH值分>4.5定义为1， <4.5定义为0；清洁度按≤Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分别定义为2、3、4；白细胞按少量、1+、2+、3+分别定义为0、1、2、3；脓细胞、霉菌、滴虫和线索细胞按镜下可见和未见分别定义为0、1；H2O2 按<2μmol/l定义为0、>2μmol/l定义为1；唾液酸苷酶、白细胞酯酶按实验阳性定义为1、阴性定义为0，统计录入。利用SPSS10.0统计软件进行相关因素的logistic回归分析。见表2。从分析结论可以发现，脓细胞和霉菌存在与HPV6.11、HPV16.18、HPV6.11/16.18感染并无相关性，但清洁度、H2O2浓度、pH值、白细胞、滴虫、线索细胞、白细胞酯酶与HPV6.11、HPV16.18、HPV6.11/16.18感染密切相关。这说明HPV感染机体后，一般不引起机体的强烈免疫反应。生殖道微环境的改变，上皮细胞受损均可使HPV感染机会增加。表2 HPV6.11、16.18、HPV6.11/16.18相关因素的logistic回归分析（略）
(2)促进HPV6.11、HPV16.18感染严重程度相关因素多因素方差分析：分析过程中，将HPV6.11、HPV16.18、HPV6.11/16.18 DNA拷贝数103～105、106～107、>107分别定义为1、2、3，DNA拷贝数低于检测线定义为0；其它定义同上。利用SPSS10.0统计软件，将与HPV感染相关的清洁度、H2O2浓度、pH值、白细胞、滴虫、线索细胞、白细胞酯酶与HPV6.11、HPV16.18感染程度进行多因素方差分析。见表3。从分析结论可发现，只有清洁度和H2O2浓度与HPV6.11/16.18感染和加速感染进程密切相关。pH值、白细胞、霉菌、滴虫、线索细胞、白细胞酯酶虽与HPV6.11/16.18感染关系密切，但并不能在加速HPV感染进程方面起到重要作用。表3 促进HPV6.11、HPV16.18感染严重程度相关因素多因素方差分析（略）
3 讨论
HPV病毒感染是最常见的性传播病毒感染，它在女性和男性生殖系统上皮性肿瘤的发生中起到重要作用。研究发现，随着宫颈病变的进展，HPV检出率逐渐升高，宫颈癌组织中，高危型HPV-DNA的检出率＞99％。高危型HPV持续感染，也使宫颈癌的风险增加＞250倍。目前认为HPV病毒是宫颈癌的主要致病病原体［5］。国际癌症研究中心在2004年提出：HPV感染是宫颈上皮内瘤变和鳞癌的必要因素；无持续HPV感染，就不可能发生宫颈癌；HPV检测是宫颈癌筛查和追踪管理有效手段［6］。HPV病毒感染可造成局部各层上皮细胞增生。HPV6.11、16.18型感染主要部位为肛门生殖道上皮细胞，引起尖锐湿疣、上皮内新生物形成和宫颈癌。
本研究显示，清洁度、H2O2浓度、pH值、白细胞、滴虫、线索细胞、白细胞酯酶与HPV6.11、HPV16.18、HPV6.11/16.18感染密切相关。可能是由于细菌、滴虫等感染，导致生殖道微生态的改变，使生殖道H2O2浓度、pH值发生相应改变，机体炎症产生，生殖道上皮细胞受损， 使得HPV侵入上皮细胞内的机会增加，引起继发感染。HPV首先进入局部损伤部位的上皮细胞底层，感染基底上皮细胞，从而引起和加重临床症状，故生殖道上皮细胞损伤就成为HPV感染而可能导致宫颈癌的必要条件。
但进一步研究却发现，只有清洁度和H2O2浓度与HPV6.11/16.18感染和加速感染进程密切相关，pH值、白细胞、霉菌、滴虫、线索细胞、白细胞酯酶虽与HPV6.11/16.18感染关系密切，但并不能在加速HPV感染进程方面起到重要作用。说明HPV感染后，一般不引起机体的强烈免疫反应，具有免疫逃逸性，pH值、白细胞、霉菌、滴虫、线索细胞、白细胞酯酶等主要作用引起而不是加速上皮细胞损伤，而清洁度则主要是反应上皮细胞的受损情况，生殖道清洁度高，说明上皮细胞损伤越严重，HPV侵入上皮细胞内的机会增加。生殖道H2O2主要是由产H2O2乳酸杆菌产生。现在研究已经表明产H2O2乳酸杆菌的减少与宫颈上皮内瘤样病变的发生密切相关。H2O2浓度越低，产生H2O2乳酸杆菌数量下降最显著，此时上皮细胞内复制的HPV病毒负荷量也相应增加，生殖道粘膜上皮细胞越易受到感染。HPV侵入受损上皮细胞的机会增加，宫颈炎转变为宫颈癌的几率也相应增加。
【】
1 Daling JR,Madeleine MM,Schwartz SM,et al. A population-based study of squamous cell vaginal cancer: HPV and cofactors. Gynecol Oncol,2002,84: 263～270.
2 Nuria Margall, Xavier MG, Miguel Chillon,et al. Detection of Human Papillomavirus 16 and 18 DNA in Epithelial Lesions of the Lower Genital Tract by In Situ Hybridization and Polymerase Chain Reaction: Cervical Scrapes Are Not Substitutes for Biopsies. Jourmal of Clinical Microbiology, 1993，31(4): 924～930.
3 Swan DC,Tucher RA,Tortolero-Luna G,et al. Human papillomavirus DNA copy number is dependant on grade of cervical disease and HPV type. J Clin Microbiol,1999,37: 1030～1034.
4 张国荣, 董学君, 郑专，等. 女性宫颈炎患者2 1种HPV基因型的分子流行病学调查. 中华感染学杂志,2007, 17(8):926～928.
5 徐建国, 梁国栋, 邢来君，等译. 临床微生物学手册. 北京: 出版社, 2005.1515.
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