血管紧张素-（1-7）对肺动脉平滑肌细胞增殖的影响
作者：黄立功 李刚 梁勇 夏发明 文石兵 张谨
【摘要】 目的 探讨血管紧张素-（1-7）［ANG-（1-7）］对体外培养兔肺动脉平滑肌细胞增殖的影响。方法 体外培养兔肺动脉平滑肌细胞，鉴定后传代培养，取4～7代细胞，应用不同浓度ANG-（1-7）干预，并与血管紧张素-II(ANG-II，浓度10-6mol/L)、空白组对照。通过台盼蓝染色法细胞计数、四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法，确定肺动脉平滑肌细胞的生长趋势变化。结果 10-12～10-10mol/L浓度ANG-（1-7）与相应对照组比较，细胞数、光吸收值 （A值）变化不明显，无统计学意义， 10-9～10-5 mol/L浓度组，ANG-（1-7）+ANG-II(浓度均为10-6)组与空白对照组比较，细胞数和A值均下降，差异有统计学意义，与血管紧张素-II组比较差异也有统计学意义；10-6、10-5浓度组与ANG-（1-7）+ANG-II(浓度均为10-6 mol/L)组引起的变化差异不明显，无统计学意义。结论 ANG-（1-7）呈剂量依赖性抑制胎牛血清诱导的兔肺动脉平滑肌细胞增殖，在浓度为10-6时效果最明显，再增加浓度效果无明显增强，这种抑制作用与 ANG-II的存在无明显关系。
【关键词】 血管紧张素-（1-7） 肺动脉高压 肺血管平滑肌细胞。
【Abstract】 Objective To explore the effect of ANG-（1-7）on proliferation of rabbit arterial smooth muscle cells ex vivo. Methods The rabbit arterial smooth muscle cells were cultured ex vivo, cells of 4-7 generation were divided into groups interfered with ANG-（1-7）, positive control groupsinterfered with ANG-II(10-6mol/L) and blank control group .Cell counting with trypanblau dying and MTT were used to evaluate the growth of cells in different groups and results were compared . Results The data changes in group with ANG-（1-7）of 10-12,10-10mol/L concentration were not significantly different compared with the contol groups , those in group with 10-9-10-5 mol/L and group with ANG-（1-7）+ANG-II(both concentrations were 10-6 mol/L) were lowered significantly compared with that in blank control group and ANG-II group ;data change in 10-6、10-5 mol/L group were not significantly different compared with ANG-（1-7）+ANG-II(both concentrations were 10-6 mol/L) . Conclusions ANG-（1-7）inhibits the proliferation of rabbit arterial smooth muscle cells ex vivo ,and the inhibitory effect is dose dependent ,which is most significant at 10-6 mol/L and will not increase with higher dose .The effects is not related with the existance of ANG-II.
【Key words】 ANG-（1-7） pulmonary hypertension pulmonary vascular smooth muscle cell
肺动脉高压是影响先天性心脏病预后的重要因素之一，先天性心脏病患者一般先出现动力性肺血管阻力增加，随着病情进展，肺血管壁细胞在高肺血流的作用下，细胞间调控失衡，从而引起平滑肌细胞增殖及细胞外基质堆积，出现肺血管结构重构［1］。组织学研究证实，平滑肌细胞的增殖和肥大及肺阻力血管的肌化在这一复杂过程中起着非常重要的作用。近年来，血管活性因子在肺血管重构中的作用引起了研究者的重视，其中ANG-II通过引起一系列生长因子的分泌增加，ANG-（1-7）是血管紧张素系统生物活性成分之一，它由血管紧张素-I和血管紧张素-II转化而来，被 认为是一种新的血管舒张因子，其作用与ANG-II相拮抗。ANG-（1-7）可能通过促进释放一氧化氮(NO)，生成前列腺素，增强缓激肽的作用引起血管舒张，并且已经证实对不同条件下主动脉平滑肌细胞增殖有抑制作用［2，3］，作者将ANG-(1-7)应用于体外培养的兔肺动脉平滑肌细胞，探索它对体外培养肺动脉平滑肌细胞的影响。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与器材
1.5kg雌性家兔（西安大学动物中心提供）， DMEM，ANG-II，ANG-（1-7）（Sigma），DMSO，MTT（Amresco）,胎牛血清（民海），谷氨酰胺（Sigma），α- actin抗体（北京中山），青霉素，链霉素（华北制药），6、96孔培养板（Corning），胰蛋白酶（Sigma）。
1.2 试验方法
(1)细胞培养与鉴定：参照胡德辉等［4］的方法，将健康家兔击昏，颈动脉放血致死，无菌操作开胸，速取心肺置于盛有无菌PBS的培养皿中漂洗3～4遍。寻出肺动脉后，剪去心脏，细心分离肺内小动脉(第一、二级肺内动脉),取其末梢段(内径为200～300μm)。将分离出的肺内小动脉条剪碎并冲洗，静置3 min，弃悬浮组织和上清液，将沉淀的组织块均匀地种于培养瓶，置95%空气和5%CO2培养箱中培养3～4h，翻转培养瓶，小心加入含15%胎牛血清的 DMEM 6～8ml,拧松培养瓶盖，固定于95%空气和5%CO2培养箱。8～9d可发现有细胞从组织块周围长出，细胞生长至组织块周围细胞面积增大不明显时，0.25%胰蛋白酶消化传代。经相差显微镜观察呈典型的“峰谷”生长，用鼠抗兔血管平滑肌细胞单克隆抗体（α-actin抗体）免疫组化鉴定为平滑肌细胞后，继续传代。试验用4～7代细胞。(2)实验分组：对照组：培养液中不加任何干扰因素；ANG-（1-7）组：细胞在培养板中生长24h后，分别加入10-12～10-5mol/L八个不同浓度进行干预；ANG-II组：细胞在培养板中生长24h后，分别加入10-6mol/L浓度进行干预；ANG-（1-7）+ANG-II组：细胞在培养板中生长24h后，同时加入浓度10-6mol/L ANG-（1-7）和ANG-II进行干预。(3)台盼蓝染色法细胞计数：选择生长良好4～7代的细胞，0.25%胰蛋白酶消化并计数，制成细胞悬液，接种于96孔板，每孔1×105，按照上述分组培养，48h后各浓度取6孔消化制成单细胞悬液，台盼蓝试剂染色后用血球计数板在倒置显微镜下计数。(4)MTT（四甲基偶氮唑蓝）比色法：采用上述方法接种细胞于96孔板，干预48h后，加入噻唑蓝20μl/孔，37℃，5%CO2孵箱中培养4h，弃去上清液，加入150μl DMSO振荡仪振荡10min，在酶联免疫检测仪上以490nm波长激发测各孔的吸光值（A值）。
1.3 统计学处理
采用SPSS 13.0统计软件，进行单因素方差分析。
2 结果
2.1 台盼蓝染色法细胞计数（1×105）和MTT比色法A值
见表1。表1 台盼蓝染色法细胞计数（1×105）和MTT比色法A值（略）
2.2 细胞计数
与正常对照组比较，ANG-(1-7)在浓度为10-9～10-5mol/L时，细胞数增加量明显减少，最多减少12%（浓度为10-5时）， 表现为抑制细胞生长，随着浓度的增加抑制作用更明显，在浓度为10-6mol/L时达到最大程度，再增加浓度时，抑制效果无明显变化。ANG-II组表现为促进细胞生长趋势，其48h细胞数明显多于对照组和ANG-(1-7)各干预组。在ANG-II存在时，ANG-（1-7）的抑制作用无明显变化。
2.3 MTT结果
A值的变化趋势与细胞计数的变化基本一致，ANG-（1-7）呈剂量依赖性的降低A值，在浓度为10-6、10-5mol/L时达到最大程度，与ANG-II组的变化趋势相反，且ANG-（1-7）的降低A值水平与ANG-II的存在与否无明显关系。
3 讨论
肺动脉平滑肌细胞在肺部疾病的重要性已经通过大量慢性肺疾病患者的组织学研究得到证实，包括平滑肌细胞的异常增殖和肥大。肺动脉高压时血管平滑肌在各种 刺激因素刺激下，动脉的肌化及平滑肌细胞表型的转化，血管平滑肌细胞发生增殖、肥大形成肺动脉高压和血管平滑肌细胞异常增殖之间的恶性循环。不同部位的 平滑肌细胞对刺激的反应不同，不光对各种增殖因素的反应、还包括对抑制性调节因子的反应，有学者［４］发现前列腺素可抑制远端肺动脉平滑肌细胞的增殖而不抑制来自近端肺动脉的平滑肌细胞。由于机体是复杂的因素综合体，很难说明是某一因素在肺动脉高压的血 管构型重建中起决定作用，如交感活性增高，去甲肾上腺素分泌增多，以及肾素-血管紧张素系统活性增强都可影响肺动脉高压过程中的血管重构。
ANG -（1-7）是新近发现的肾素-血管紧张素系统的多肽片断，通过其特异性G-蛋白偶联受体Mas发挥与ANG-II相反的生理作用，如扩张血管，抗增殖， 抗血小板凝聚等，它可由有ANG-I和ANG-II转化而来，ACE2可被看成是它形成的关键酶。很多研究已经证实它在心血管系统发挥着重要作用，也有研 究发现它可能在肺部疾病中发挥作用。Keiji Kuba［5］等发现ACE2是SARS病毒引起的肺部感染中的关键性受体, Gallagher［6］等研究证实ANG-（1-7）可抑制体外培养的肺癌细胞的生长，并且肺为ANG-（1-7）的主要降解场所之一。本实验将ANG-（1-7）应用于 体外培养的肺动脉平滑肌细胞，探索它在肺动脉高压形成中的作用。 实验结果显示，在10-12～10-5mol/L浓度范围内，ANG-（1 -7）呈剂量依赖性的抑制体外培养，由低浓度胎牛血清诱导（10%）的肺动脉平滑肌细胞增殖，浓度为10-6mol/L时达到最大抑制效应，这一结果与 ANG-（1-7）对体外培养的主动脉平滑肌细胞影响的结果一致。 研究还发现，ANG-（1-7）的这种抑制效应并不依赖ANG-II发挥 作用，有无ANG-II存在并不影响ANG-（1-7）发挥作用，对效应的程度也没有明显影响，结果所示，ANG-（1-7）浓度为10-6，10-5mol/L组与ANG-（1-7）+ANG-II组的差异无统计学意义，这与部分学者认为ANG-（1-7）依赖ANG-II的观点不一致。
体循环与肺循环平滑肌细胞之间的差异，可能比已经证实的新生肺动脉壁不同表型血管平滑肌细胞之间的差异要大，尤其是远端肺动脉，这些差异包括离子通道的表达，某些关键酶的活性如腺苷酸环化酶［7］，NO合酶的表达和作用等。本研究结果显示，ANG-（1-7）对肺动脉平滑肌细胞的增殖发挥着与主 动脉平滑肌细胞相似的作用，提示它在肺动脉高压形成过程中可能对肺血管重构产生影响，为以后对肺动脉高压的发病机制研究提供了新的理论依据。
【】
1 Wei B, Du JB, Qi JG, et al. L-Arg impact pulmonary vascular structure in rats with an aortocaval shunt.J Surg Res,2002,108:20～31.
2 William B， Strawn， Carlos M，et al. E. Ann Tallant，Angiotensin-(1-7) Reduces Smooth Muscle Growth After Vascular Injury. Hypertension,1999,33:207～211.
3 Ernest J， Freeman， Guy M，et al. Ann Tallant,Angiotensin-(1-7) Inhibits Vascular Smooth Muscle Cell Growth. Hypertension,1996,28:104～108.
4 胡德辉，刘惠君，马传桃. 兔肺内小动脉平滑肌细胞培养. 应用生杂志，1997，13（1）：80～82.
5 Keiji Kuba, Yumiko Imai. A crucial role of angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) in SARS coronavirus-induced lung injury. Nature Medicine Volume，2005，11(8):875～879.
6 Gallagher, Patricia E，Ann Tallant E. Inhibition of human lung cancer cell growth by angiotensin-(1-7) Carcinogenesis. November，2004,2045～2052.
