血栓通针对急性脑梗塞大鼠S?100b及神经功能的影响

【摘要】  目的］探讨血栓通针对脑缺血损伤的保护作用。［方法］大鼠54只, 随机分为假手术组、对照组、药物组，每组再分为脑缺血1d、3d、7d 组, 每组6 只。应用线栓法建立大脑中动脉阻塞 (MCAO) 模型,药物组于术前3d开始注射血栓通针进行干预,对照组给予等量生理盐水。采用Bederson 6级5分法进行神经功能评分，免疫组化检测S?100b的表达。［结果］①神经功能评分：药物组在1d，3d，7d均低于对照组,其中7d有统计学意义(P<0.05)。②脑组织S?100b阳性表达：药物组与对照组在各时间点阳性细胞数增多，表达强度增加，与假手术组比较有显著差异 (P<0.01)。与对照组比较，药物组阳性细胞表达强度在3d，7d较低，有统计学差异(P<0.05)。③血清S?100b变化：对照组和药物组血清S100 水平在 1d、3d、7d均明显升高，与假手术组比有显著差异 (P<0.01);药物组在各时点比对照组低(P<0.05)。［结论］血栓通针对急性局灶性脑缺血引起的脑损伤具有一定的保护作用，其保护机制可能与抑制S?100b蛋白、抑制其神经毒性作用有关。

【关键词】  血栓通针；脑缺血；S?100b蛋白；神经功能

infarction rats,by observing the expression of S?100b and neural function. ［Methods］A total of 54 sprague?Dawley male rats were divided randomly into 3 groups as follows: sham groups, compare groups and medicine groups. Model group and medicine groups were set up models with middle cerebral artery occlusion using monofilament. Before operation,sham groups could drink and eat freely, medicine groups were injected with Xue Shuan Tong for three days,and model groups were injected Ns with the same dose. Observe the neural function and the expression of s?100b.［Results］1.Neural functional score: The score of medicine groups was lower than model groups’, and has statistical significance on 7 days(P<0.05). 2.The expression of S?100b: S?100b positive cells were rarely expressed in sham groups but evidently expressed in compare and medicine groups at the same time (P<0.01). Compared with compare groups, medicine groups were less expressed on the days of 3 and 7(P<0.05). ［Conclusion］Xue Shuan Tong has some protection in acute focal cerebral infarction.Its protective mechanism may be concerned with refraining the expression of S?100b and refraining neurotoxic effect.

　　Key words: Xue Shuan Tong;cerebral ischemia;S?100b; neural function
   
　　S?100b蛋白被认为是神经胶质的标记蛋白，是脑组织特异性蛋白。在生理浓度水平，它具有神经营养作用，在急慢性颅脑损伤或神经变性状况下，星形胶质细胞加倍释放S100b蛋白，则产生神经毒性作用［1］。血栓通针已广泛用于急性脑梗塞的临床治疗中，并取得了满意疗效，但其机制还不完全清楚，现通过观察S?100b蛋白的表达及神经功能损伤情况来观察药物血栓通针的保护作用。

　　1  材料与方法

　　1.1  动物分组与模型建立  成年健康雄性SD大鼠54只, 体重220～260g, 清洁级, 由温州医学院实验动物中心提供。随机分为假手术组(n=18)、对照组(n=18)、药物组（n=18），每组再分为脑缺血1d、3d、7d 组, 每组6 只。参照Longa［2］线栓法制作右侧大脑中动脉栓塞（MCAO）模型，模型成功的标志: 动物苏醒后出现左侧Horner 征、右侧以前肢为重的偏瘫, 爬行时向右侧划圈，神经功能评分在1～3分。假手术组除不插线外, 其余步骤同实验组。实验中出现出血过多、死亡, 以及术后评分为0或者5的动物弃去不用, 另取动物补充。

　　1.2  干预治疗措施  药物组在术前3d开始用血栓通针腹腔注射，剂量为10mg/kg，1次／d。对照组给予同剂量的生理盐水。假手术组自由饮食。

　　1.3  神经功能评分  神经功能学评分：大鼠缺血损伤后苏醒后2h及1d，3d，7d观察神经功能障碍并评分。评分标准采用Bederson［3］6级5分法：正常为5级(0 分)；对侧上肢不能完全伸展为4 级(1 分)；向对侧推时抵抗力下降（置于光滑塑料板上）为3级(2 分)；提尾时向对侧转圈为2 级(3 分)；自动转圈为1 级(4 分)；无自发性活动、意识障碍为0 级(5 分)。

　　1.4  标本采集  假手术组、治疗组和对照组动物按规定的时间点取材。大鼠以10%水合氯醛(300mg/kg) 腹腔注射麻醉后, 仰卧固定,暴露心脏，（1）从左心室快速取血1.5ml，3000r/min离心取上清100ml -70℃冰箱保存待用。（2）经左心室先用生理盐水250ml快速灌注，再用4%多聚甲醛溶液约250ml灌注固定后断头完整取脑, 置于4%甲醛溶液固定2h。切取视交叉前后方约2mm 的脑组织，常规脱水、透明、石蜡包埋。自视交叉后缘连续冠状切片, 片厚5μm, 每隔10 张抽取1 张, 粘于多聚赖氨酸处理过的的玻片上，4℃冰箱保存备用。

　　1.5  S?100b免疫组化检测  兔抗S?100b多克隆抗体由北京中杉生物技术有限公司提供。SABC免疫组化试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供。标本切片常规脱蜡、水化，按试剂盒提供的实验步骤进行操作, DAB 显色, 光镜下观察, 胞核出现棕色颗粒为阳性着色。高倍镜下(400 倍) 在皮质和海马区随机各取5 个视野，用图象软件计数阳性细胞密度值，以均数±标准差表示。

　　1.6  血清S?100b蛋白的检测  采用酶联免疫吸附法测定血清S100含量，试剂盒由北京中杉生物技术有限公司提供。操作严格按照说明书。

　　1.7  统计学分析  采用SPSS 11.0 软件进行统计学分析,组间比较用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  神经功能评分  脑梗死后各时间点评分见表1。

　　表1  大鼠脑梗死后神经功能缺损评分（略）

　　同时间点与对照组比较，△P<0.05

　　2.2  脑组织S?100b阳性表达  见表2。

　　表2  不同时间点大鼠脑组织S?100b阳性表达OD值（略）

　　与假手术组比，*P＜0.01，与对照组比，△P＜0.05

　　2.3  血清S?100b变化  见表3。

　　表3  两组大鼠血清S100 水平（略）

　　与假手术组比较，★P<0.01, 与对照组比较; △P<0.05

　　2.4  各时间点S?100蛋白免疫组化图  见图1～3。

　　药物组模型组

　　图1  第1天梗死灶边缘S?100阳性细胞明显表达（400×）（略）

　　药物组模型组

　　图2  第3天梗死灶边缘S?100阳性细胞强烈表达（400×）（略）

　　药物组模型组

　　图3  第7天梗死灶边缘S?100阳性细胞表达较少（400×）（略）

　　3  讨论
       
　　神经功能评估能直接反映缺血性脑损伤的程度，而且与皮层缺血坏死神经元的数目密切相关。实验发现，除假手术组之外，其余各组大鼠在手术结束麻醉清醒之后均出现一定程度的神经功能缺损症状。脑梗死后各时间点评分详见表1，梗死后第1d评分高，第3d评分达到高峰，第7天有下降，表明大鼠急性缺血性损伤后，在前几天损伤最为显著，随着时间的延长，可有一定程度的自我修复作用。给予血栓通针后，较对照组，各时间点神经功能都有不同程度好转，其中第7天最明显，差别有统计学意义(P<0.05)。表明中药起作用相对较慢，但可在一定程度上促进动物的神经功能的修复。
       
　　S?100蛋白是一组高酸性钙结合蛋白，分为S?100a0、S?100a、S?100b三种形态，其中S?100b特异性地存在于中枢神经胶质细胞、施旺细胞，脑干的大部分感觉神经和小脑核也有明显分布，因此，S?100b蛋白被认为是神经胶质的标记蛋白，是脑组织特异性蛋白。在生理浓度水平，它具有神经营养作用，维护神经元稳定、刺激轴突生长、调节突触接头功能及钾通道活性；在急慢性颅脑损伤或神经变性状况下，星形胶质细胞加倍释放S100b蛋白，产生神经毒性作用。研究证实: 缺血性脑血管病急性期的血浆和脑脊液中的S100B蛋白升高明显, 主要原因是由于神经胶质细胞坏死后S100B蛋白的释放和血脑屏障受破坏后通透性的增高。Foereh等［4］在对缺血性脑梗塞患者的研究中发现，血清S100B蛋白浓度在发病后2～4 d达到峰值。峰值的高低及出现的时间早晚主要取决于梗塞面积的大小。可见，S100B蛋白的动力学改变与发病的性质和病情的严重程度具有密切关系。
       
　　本实验显示，脑组织S?100b蛋白在第一天表达即上调，第3天达高峰，第7天又下降，但比正常水平要高。同时，血清中S100 水平在 第1、3、7天均明显升高，且在第1天即达高峰，后几天虽有所下降，但仍持续维持在较高水平，与假手术组比有显著差异 (P<0.01)，表明脑组织缺血后神经胶质细胞坏死，S100B蛋白可马上大量释放并通过血脑屏障进入血液循环，并持续较长时间。同时实验还发现，药物组与模型组比较，脑组织S?100b蛋白第3天比对照组表达更少，有显著差异 (P<0.05).同样，药物组S100 水平在各时点也均比对照组低(P<0.05)。表明血栓通针在一定程度上可以抑制神经胶质细胞坏死,抑制S?100b蛋白的释放，从而起神经保护作用。
       
　　从本实验可知，其保护作用可能还与抑制S?100b蛋白的释放，抑制炎症反应及神经毒性作用有关。

【】
  1］ Buttner T,Weyers S,Postert T,et al.S?100 protein:senum marker of focal brain damage after ischemic terrir to rial MCA infarction.Stroke，1997,28(10): 1961?1965.

　　［2］ Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S,et al.Reversible middle eere—bral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20(1):84.

　　［3］ Berderson JB, Pitts LH, Tsuji M, et al.Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination［J］.Stroke, 1986, 17(3):472?476.

　　［4］ Foereh C，Otto B，Singer OC.et al.Serum S100B preelicts a malignant course of infarction in patients with acute middle cerebral artocclusion［J］.Stroke，2004，35(9)：2160?2164.