聚乙二醇－牛血红蛋白停搏液对离体心脏功能和超微结构的影响

【摘要】  目的 观察含聚乙二醇－牛血红蛋白（polyethylene glycol-bovine hemoglobin, PEG-bHb）的心脏停搏液对离体心脏功能的影响。 方法 32只成年雄性S-D大鼠根据停搏液不同随机分为4组，麻醉后开胸取心，建立Langendorff离体心脏灌注模型，平衡20 min后灌注冷St. Thomas液或三种不同浓度的PEG-bHb停搏液，30℃保持60 min后恢复灌注。记录各组左室压（LVDP）、左心室内压最大变化速率（±dp/dtmax）和冠脉流出量（CF）等血流动力学指标，并行超微结构观察。 结果 恢复灌注后，三个PEG-bHb组的LDVP、±dp/dtmax及CF均显著高于St.Thomas液组（P<0.05），超微结构也得到较好的保护。三个PEG-bHb组之间除CF外，其余指标均无明显差异（P>0.05）。 结论 以PEG-bHb制成的含血停搏液可以改善离体心脏的血流动力学表现和超微结构。

【关键词】  聚乙二醇－牛血红蛋白 停搏液 心脏功能 血流动力学 超微结构

    Abstract: OBJECTIVE   To evaluate the effect of polyethylene glycol-bovine hemoglobin (PEG-bHb)-containing cardioplegic solution on cardiac function in isolated animal hearts.  METHODS  The hearts of 32 male S-D rats were harvested and transferred to langendorff circuit. They were divided into 4 groups according to cardioplegia: St.Thomas or 3 different concentrations of PEG-bHb in St.Thomas solution. After 20 min balance period, hearts were perfused with cold (4℃) cardioplegic solutions, and preserved at 30℃ for 60 min, then reperfused.  RESULTS  After reperfusion, left ventricular developed pressure (LVDP), derivative of pressure (±dp/dtmax) and coronary flow (CF) were higher in PEG-bHb groups (P<0.05). Ultrastructures were better preserved in PEG-bHb groups. There was no difference among 3 PEG-bHb groups except CF.  CONCLUSION  PEG-bHb in cardioplegic solutions can improve hemodynamic values and ultrastrctures in hearts after ischemia.

    Key words：   Polyethylene glycol-bovine hemoglobin; Cardioplegic solution;Myocardial function;Hemodynamics;Ultrastructure

    70年代晶体停搏液成功用于心脏手术，随后Follette等［1］提出了含血心脏停搏液。大量的研究表明含血停搏液的心肌保护效果优于晶体停搏液，并且已广泛应用到成人体外循环心脏手术。聚乙二醇－牛血红蛋白（Polyethylene Glycol-bovine Hemoglobin, PEG-bHb）是一种可以携氧的人工血液代用品［2］。本实验将聚乙二醇－牛血红蛋白加入St. Thomas停搏液中，制成“含血停搏液”，观察其对离体心脏功能和超微结构的影响。

    1  材料与方法

    1.1  实验动物和试剂  32只成年雄性SD大鼠（阜外心血管病动物实验中心提供），体重350～400 g，根据使用停搏液的不同，随机分为4组，每组8只。A组：使用St. Thomas液，B组、C组、D组：分别使用1∶2、 1∶4、1∶8 PEG-bHb停搏液。

    PEG-bHb溶液含血红蛋白55～60 g/L，纯度≥99.9%，胶体渗透压为110～160 mmHg（北京凯正生物工程发展有限责任公司提供）。1∶2（或1∶4或1∶8）PEG-bHb是指：PEG-bHb溶液中加入15％KCl 10 ml/L，然后与St. Thomas液按1∶2（或1∶4或1∶8）混合，配成不同浓度的“含血停搏液”，并吹入O2氧合。测定其胶渗压依次为13 mmHg，7mmHg，1.2 mmHg。

    1.2  实验方法  大鼠称重后，用戊巴比妥钠（50mg/kg）腹腔注射麻醉，仰卧固定，经股静脉注入肝素300 IU/kg，迅速开胸，于主动脉和右锁骨下动脉交界处离断主动脉，取出心脏快速转移并固定于Langendorff灌流装置上，用Krebs-Henseleit(K-H)液经主动脉恒压（80cmH2O）灌注，温度保持37℃，K-H液用95％O2～5％CO2饱和。肺动脉根部切开，充分引流冠脉流出液。切开左心耳，将有压力传感器的球囊送入左心室，球囊内注入生理盐水，使左室舒张末期压维持在10 mmHg，传感器与信号采集系统连接。在此状态下平衡20 min。随后停止灌流，并灌注4℃停搏液20 ml，灌注时间约3 min，灌注压力约80 mmHg。心脏停跳后，浸于30℃K-H液中保存60 min，然后重新用37℃K-H液灌流，观察60 min结束。取平衡20 min时，及复灌20min、30 min、40 min、50 min、60min时测定左室发展压（LDVP），左心室内压最大变化速率（±dp/dtmax）及冠脉流出量（CF）。实验结束后，切取左室游离壁心肌行电镜病理检查。

    1.3  数据处理  应用SPSS13.0软件处理，所有数据采用均数±标准差(±s)表示。基础值（平衡20min时）的比较采用单因素方差分析，复灌后血流动力学恢复率的组间差异采用重复测量资料的方差分析。P<0.05为有显著性差异。

    2  结  果

    2.1  血流动力学指标  四组血流动力学基础值（平衡20 min时）无显著性差异（P>0.05）（见表1）。复灌后血流动力学恢复率均值见图1～4。B组、C组、D组的LVDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax均明显高于A组（P<0.01），B组、C组、D组之间无明显差异（P>0.05）。C组的CF均明显高于B组、D组及A组（P<0.01），B组、D组之间CF无明显差异（P>0.05）且明显高于A组（P<0.05）。

    2.2  超微结构观察  A组：心肌纤维疏松，局灶性肌溶解，细胞间质明显水肿；线粒体明显肿胀，嵴排列紊乱，可见空泡变性（图5-A）。B组：心肌结构清晰，肌纤维排列尚整齐，心肌细胞间质轻度水肿；线粒体无明显水肿（图5-B）。C组：心肌结构清晰，肌纤维排列整齐，肌节清晰；线粒体无明显水肿（图5-C）。D组：心肌纤维疏松，细胞间质水肿；线粒体肿胀，基质变浅，线粒体嵴有破坏（图5-D）。表1  血流动力学基础值

    3  讨  论

    心肌保护在心脏手术中具有重要意义。心肌保护的逐步改进推动了心脏外科手术的。随着手术技术的进步，患者群体的构成也在发生变化，高龄和新生儿患者增多，心脏病变严重、心功能差者增多，复杂手术增多，这就对心肌保护提出了更高的要求。因此，心肌保护措施仍有改进的意义和空间。大量的研究显示含血停搏液优于晶体停搏液［3］，主要是由于其具有携氧功能，可以使心脏停搏于有氧环境，减少ATP的消耗；另外，还具有一定的缓冲能力和抗氧化能力，并具有较接近生理的渗透压［4］。

    如今含血停搏液已广泛用于体外循环心脏手术中。与晶体停搏液相比，含血停搏液的灌注装置增加了体外循环管路的预充量，一部分患者可能需要应用库血才能维持足够的血细胞压积。然而输血具有并发症［5］，并且血源日趋紧张，特殊血型（如Rh阴性）者更有可能在需要时得不到用血。减少预充量对特殊血型及血细胞压积或血容量不高的患者非常有意义。将PEG-bHb作为携氧剂配成含血停搏液可以免去停搏液灌注装置对循环血量的分流，减少预充量，实现节约用血。

    本实验所用6％PEG-bHb溶液含血红蛋白55～60 g/L，分子量110～140 kDa，渗透压300～360mOsm/L，胶体渗透压为110～160 mmHg，P50值10～14mmHg。PEG经修饰后，牛血红蛋白周围形成水化膜，遮蔽了抗原位点，其抗原性和免疫源性降低到一定标准，因此不会产生过敏反应［6］。实验结果显示，与晶体停搏液比较，含PEG-bHb停搏液使复灌后血流动力学明显改善：心肌收缩功能（LDVP）及顺应性（±dp/dtmax）较好，冠脉循环（CF）较通畅。说明与自体氧合血停搏液相似，含PEG-bHb停搏液也比晶体停搏液具有优势，它使心脏停搏于有氧环境，避免停搏短时间内的电机械活动对ATP的消耗，使有氧氧化得以进行，无氧酵解降低到最低程度，从而大大降低了心肌细胞的缺氧损伤，较容易偿还缺血期间的氧债，改善再灌注后的心功能。Carlucci等［7］比较了Celsior液及含4%人血红蛋白、4%牛血红蛋白、8%牛血红蛋白Celsior液对大鼠心脏的保存效果：6 h之内4％及8％牛血红蛋白组的心肌组织的高能磷酸化合物水平显著高于另外两组，提示了其较好的供氧效果。Serna等［8］采用持续灌注保存液的方法，对离体兔心经主动脉根部持续灌注3%PEG-bHb溶液或晶体液，8 h后测定心脏功能显示：PEG-bHb组要优于晶体液组，因此认为原因在于PEG-bHb溶液具有携氧和胶体渗透压的作用。

    由于6％PEG-bHb胶体渗透压非常高，本实验将6％PEG-bHb稀释至三种浓度，K＋浓度均保持20mmol/L；胶体渗透压依次为13 mmHg，7 mmHg，1.2 mmHg；血红蛋白浓度分别为2%，1.2%，0.7%。B组、C组、D三组的血流动力学指标均优于A组；另外，C组的CF还高于B组、D组，提示其再灌注后的无复流现象较轻，心肌灌注较好。因此，将6%PEG-bHb与St. Thomas液按1∶4配制的浓度较为适宜，既足以携氧、减轻缺血损伤，又有较低的粘滞度、保持微循环通畅。

    在本实验的基础上，可将PEG-bHb停搏液与自体血停搏液比较，进一步评估其效果；另外，可试验于未成熟心肌，为其应用于小儿（应用库血的重要群体）提供依据。

【】
  ［1］ Follette DM, Steed DL, Foglia R, et al. Advantages of intermittent blood cardioplegia over intermittent ischemia during prolonged hypothermic aortic clamping ［J］. Circulation, 1978, 58(3 Pt 2) :I200-1209.

［2］ Anbari KK, Garino JP, Mackenzie CF. Hemoglobin substitutes ［J］. Eur Spine J, 2004 , 13(Suppl 1):S76-82.

［3］ Ibrahim MF, Venn GE, Young CP， et al.A clinical comparative study between crystalloid and blood-based St Thomas' hospital cardioplegic solution ［J］. Eur J Cardiothorac Surg, 1999 ,15(1):75-83.

［4］ Barner HB. Blood cardioplegia: a review and comparison with crystalloid cardioplegia ［J］. Ann Thoarc Surg 1991,52(6):1354-1367.

［5］ Spahn DR, Kocian R. Artificial O2 carriers: status in 2005 ［J］. Curr Pharm Des, 2005, 11(31):4099-4114.

［6］ 侯继锋，叶苗. 聚乙二醇修饰的牛血红蛋白血液代用品抗原性和免疫原性的研究 ［J］. 生化药物杂志，2005,26(1):29-31.

［7］ Carlucci F, Miraldi F, Barretta A, et al.Preservation of myocardial energy status by bovine hemoglobin solutions during ischemia ［J］. Biomed Pharmacother, 2002, 56(5):247-253.

［8］ Serna DL, Powell LL, Kahwaji C, et al.Cardiac function after eight hour storage by using polyethylene glycol hemoglobin versus crystalloid perfusion ［J］. ASAIO J, 2000, 46(5):547-552.