延迟相吗啡预处理对兔心肌缺血再灌注损伤的保护作用

【摘要】  目的 探讨延迟相吗啡预处理对兔心肌缺血再灌注损伤的保护机制。方法 30只健康新西兰雄性大白兔随机分成3组：假手术组(C组)、缺血再灌注组(I/R组)、吗啡预处理延迟相组(M组),每组10只。C组仅行左冠脉套线而不阻断160 min；I/R组行左冠状动脉前降支阻断40 min，再灌注120 min；M组静注吗啡1.0 mg/kg， 24 h后处理同I/R组。各组分别于阻断前20 min（T1）、阻断后20 min（T2）、阻断后40 min（T3）、再灌注1 h（T4）、再灌注2 h（T5）五个时点取颈内动脉血测定血清中白介素（IL）-10和肿瘤坏死因子（TNF）-α含量。再灌注结束后用伊文思蓝和TTC染色法测心梗面积。结果 与C组比，I/R组与M组IL-10和TNF-α含量均升高,具有显著性差异(P<0.05)，但与I/R组比，M组IL-10明显升高(P<0.05),心肌梗死面积减少(P<0.05), TNF-α明显降低(P<0.05)。结论 吗啡预处理延迟相可通过调控炎性细胞因子平衡发挥心肌保护作用。

【关键词】  吗啡 延迟相预处 心肌保护 缺血再灌注损伤 细胞因子

    Abstract: OBJECTIVE   To investigate the protective effects of morphine delayed preconditioning on myocardial ischemia reperfusion injury in rabbit. METHODS  Thirty New Zealand male white rabbits were randomly assigned to control group（C  group）,ischemia reperfusion group（I/R group） and morphine group（M group）.  M group was given morphine 1.0 mg/kg, C group  and  I/R group  were given NS 1.0 ml/kg as untreated controls. Twenty-four hours later I/R group  and M group  underwent 40 min of coronary occlusion followed by 2 h of reperfusion.Blood samples were taken from arterial line at 20 min before occlusion(T1),20 min after occlusion(T2),40 min after occlusion(T3),1 h after reperfusion(T4) and 2 h after reperfusion(T5) for determination of plasma IL-10 levels and TNF-α levels. At the end of the reperfusion, infarct size(IS) and area at risk(AAR) were defined by Evans and TTC staining.  RESULTS  Morphine significantly(P<0.05)reduced infarct size(21.5%±2.4% in  M group) of the left ventricular area at risk as compared with control (37.8%±1.7% in  I/R group). M group  had a lower levels of TNF-α and a higher level of IL-10 than those in  I/R group. CONCLUSION  Morphine  preconditioning induces late cardioprotection against postischemic reperfusion injury partly by regulating cytokine in rabbit.

    Key words：  Morphine;Delayed　preconditioning;Cardioprotection;Ischemia reperfusion injury;Cytokine

    吗啡预处理具有类似缺血预处理早期相的心肌保护作用［1-2］已经得到肯定，而吗啡预处理是否具有延迟相心肌保护效应及其作用机制目前少见报道。白介素（IL）-10和肿瘤坏死因子（TNF）-α是心肌缺血再灌注（I/R）病理损伤中发挥重要作用 的炎性细胞因子［3-4］，因此，本研究拟通过观察吗啡预处理延迟相在I/R中对IL-10和TNF-α水平的影响，探讨其对心肌缺血再灌注损伤的保护作用。

    1  材料与方法

    1.1  动物分组  健康雄性新西兰大白兔30只，体重2.0～2.5 kg（中南大学湘雅医学院动物部提供），随机分成3组：假手术组(C组)、缺血再灌注组（I/R组）、吗啡预处理组(M组),每组10只。C组静注NS 1.0 ml/kg，24 h后仅行左冠脉套线而不阻断160 min；I/R组静注NS 1.0 ml/kg，24 h后行左冠状动脉前降支阻断40 min，再灌注120 min；M组静注吗啡1.0 mg/kg，24 h后处理同I/R组。所有实验动物按照“湖南省医学类实验动物饲养和管理条例”和“国际实验动物管理条例”进行喂养和处理。

    1.2  仪器设备  ①DH150呼吸机（浙江医科大学医学仪器厂）；②MD100-2分析天平（上海天平仪器厂）；③全自动生化分析仪（美国BECKMAN公司）；④内切式匀浆机（中山大学中山医学院仪器厂）；⑤5415R型高速低温台式离心机（德国Eppendorf公司）；⑥721分光光度仪（上海第三分析仪器厂）；⑦恒温水浴箱（上海仪器厂）；⑧-70℃冰箱（日本松下）；⑨压力换能器（惠普公司）；⑩450nm酶标仪（日本BIO-RAD Model 550型）。

    1.3  试剂  伊文思蓝、氯化硝基四氮唑兰、戊巴比妥钠（均为Sigma公司），IL-10和TNF-α的ELISA试剂盒（深圳晶美生物公司）。

    1.4  I/R模型制备  以戊巴比妥钠30mg/kg耳静脉麻醉后固定,气管切开插管,行纯氧机械通气,潮气量15ml/kg,呼吸频率35次/min。连接皮下电极监测标准Ⅱ导联心电图, 并在左颈内动脉穿刺置管持续监测动脉压变化。左前第4 肋间开胸,切开心包,于左冠状动脉中部用丝线结扎阻断血流造成心肌缺血, 以缺血心室壁出现发绀、运动减弱, 同时伴有心电图ST 段抬高为阻断成功。

    1.5  测定指标   

    1.5.1  IL-10和TNF-α  各组分别于阻断前20 min（T1）、阻断后20 min（T2）、阻断后40 min（T3）、再灌注1 h（T4）、再灌注2 h（T5）五个时点取颈内动脉血测定IL-10和TNF-α(夹心ELISA法)的水平。

    1.5.2  心肌梗死面积  再灌注2 h后再次阻断冠状动脉,自颈内动脉逆向注入2％伊文思蓝2 ml进行心肌染色,以区分缺血(无蓝色)和非缺血组织(蓝色)，迅速取出心脏，将其水平切成约2 mm的薄片,将心肌薄片以滤纸吸干, 剪除右室和非缺血组织后分别测质量，然后将缺血心肌片用0.5％TTC磷酸缓冲液(pH=7.4)孵育(37℃)15 min以确定梗死组织,再将坏死区(灰白色)和非坏死区(深红色)分离测质量，缺血和梗死面积以其占左室质量的百分比表示并缺血和梗死心肌面积。

    1.5.3  心肌组织超微结构  再灌注结束后，分别取各组心尖区心肌组织1 mm3备透射电镜下超微结构检查。

    1.6  统计学处理  用SPSS 13.0统计学软件行重复测量数据的方差分析，所有数据以均数±标准差(±s)表示，P<0.05为有显著性统计学差异。

    2  结  果

    2.1  血清IL-10和TNF-α浓度变化  与C组比较，I/R组和M组在心肌缺血再灌注后血清IL-10浓度均显著上升(P<0.05)；但与I/R组比较，M组浓度明显增高（P<0.05）。与C组比较，I/R组和M组在缺血再灌注后血清TNF-α浓度均显著上升(P<0.05)；但与I/R组比较，M组浓度明显下降（P<0.05）。见表1。

    2.2  心肌梗死及缺血面积变化  心肌缺血面积I/R组和M组间无明显差异（P>0.05）。与I/R组比，M组心肌梗死面积显著降低（P<0.05）。见表2。

    2.3  心肌超微结构变化  电镜下的变化：C组心肌细胞完整，排列整齐，线粒体形态正常，糖原丰富；I/R组心肌细胞水肿，心肌纤维排列模糊，排列紊乱，线粒体、内质网膜肿胀，空泡化；M组心肌细胞水肿，心肌纤维排列较紊乱，心肌纤维模糊，线粒体轻度肿胀，糖原减少。见图1、2、3。表1  各组不同时间点的血清IL-10和TNF-α浓度的变化 表2  各级心肌梗死面积及缺血面积（ 注：*与I/R组比，P＜0.05

    3  讨  论

    缺血再灌注损伤的机制之一是过度的炎性反应，其中TNF-α是主要的促炎性因子，参与机体的炎性反应和免疫反应全过程，是心肌缺血再灌注损伤连锁反应中的关键性介质，其产生快，可以触发其它的细胞因子的产生,引起细胞因子的级联反应，导致促炎性反应［5］。I/R期间，TNF-α释放增加，可激活多形核白细胞（PMN），增加细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和血管黏附分子(VCAM-1)在缺血区的聚集和表达，促进中性粒细胞聚集和释放蛋白水解酶，使细胞膜损伤和细胞自溶，导致心肌损伤［6］。本研究中，吗啡延迟相预处理后，心肌TNF-α的表达和产生显著降低，提示吗啡预处理延迟相对心肌缺血再灌注损伤的保护作用与其抑制TNF-α产生，减轻炎性反应有关。

    IL-10 是经典的抗炎性细胞因子，可抑制许多促炎性因子(如TNF-α、IL-1、IL-6等)的合成，并上调其它抗炎性因子的生成［7］。研究发现，IL-10在心肌缺血损伤中有重要的保护作用，在I/R期间，IL-10 mRNA及其蛋白表达显著上调［8］，如果IL-10表达缺失，则炎性反应加重，表现为PMN浸润增强，ICAM-1和TNF-α的聚集和表达增加，心肌梗死面积扩大，损伤加重［9］。本研究中，吗啡延迟相预处理后，心肌IL-10的表达和产生显著上调，提示吗啡预处理延迟相对心肌缺血再灌注损伤的保护作用与其上调IL-10产生和抑制炎性反应有关。

    心肌超微结构的变化是反应心肌受损伤程度的有效指标［10］，在本研究中心肌超微结构的变化，提示吗啡延迟预处理可有效减轻心肌损伤程度，与其抑制过度的炎性反应有关。

    心肌梗死面积的变化被认为是评价心肌预处理效果的“金指标”［11］，在本研究中，I/R组和M组间的缺血面积无显著性差异，表明LAD阻断效果肯定、各组LAD阻断部位基本一致。I/R组的心肌梗死面积为37.8%，而给予吗啡预处理24 h后的M组心肌梗死面积为19.7%，与I/R组相比，M组心肌梗死面积减少48%，以上结果提示吗啡预处理24 h后能显著减少缺血再灌注损伤后的心肌梗死面积，与其抑制缺血再灌注诱发的心肌炎性反应密切相关。有研究认为［12-13］，I/R通过活化核因子NF-kappaB蛋白表达，诱发TNF-α、IL-1、IL-6等促炎性因子过度表达，引发炎性反应造成心肌损伤，而下调NF-kappaB蛋白表达，则可抑制TNF-α、IL-1、IL-6等促炎症因子过度表达，并上调IL-10表达，减小心肌梗死面积，提示吗啡可能通过下调NF-kappaB蛋白表达，抑制炎性反应，减轻心肌损伤，这有待进一步研究。

    总之，本研究表明，吗啡预处理延迟相通过下调I/R病理过程中促炎性因子TNF-α的产生，同时上调抗炎性因子IL-10的产生，从而抑制I/R病理过程中的炎性反应，这可能是吗啡预处理延迟相对心肌缺血再灌注损伤的保护机制之一。

【】
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