体外循环手术对红细胞CD35、CD59及T淋巴细胞免疫的影响

           作者：胡金川,田亚平,李佳春,董培青,万彩红,谷 峰,骆 荩,高艳红,江朝光

【摘要】  目的 探讨体外循环(extracorporeal circulation,ECC)手术对红细胞CD35、CD59及T淋巴细胞免疫功能的影响。 方法 选择ECC手术病例18例，于转机前、体温最低点、转机末和术后1 d、3 d、7 d晨采集患者静脉血，测定红细胞CD35、CD59，以及T淋巴细胞CD3、CD4和CD8。 结果 ECC前至ECC末，CD35+红细胞(CD35+-E)百分率、CD59几何平均荧光强度比值(CD59-GMFIR)和CD35-GMFIR均逐渐降低，前二者在术后1 d至7 d逐渐回升，而CD35-GMFIR未见明显恢复趋势。ECC末、术后1 d时CD35+-E百分率和CD35-GMFIR，以及体温最低点、ECC末和术后1 d时CD59-GMFIR均显著低于ECC前(P<0.01或P<0.05)。至术后7 d时，CD35+-E百分率、CD35-GMFIR和CD59-GMFIR仍未恢复至ECC前水平。从ECC前至术后7 d，CD3+ T淋巴细胞(CD3+-T)百分率、CD3+CD4+-T百分率和CD4+-T/CD8+-T比值均呈现先降低后升高的趋势，体温最低点、ECC末、术后1 d和术后3 d的CD3+-T百分率、CD3+CD4+-T百分率均显著低于ECC前(P<0.01或P<0.05)，至术后7 d恢复至接近于ECC前水平，而CD4+-T/CD8+-T比值则恢复至超过ECC前水平。 结论 ECC手术使红细胞CD35、CD59及T淋巴细胞免疫功能下降，后者于术后7 d恢复，前者恢复期长于后者。

【关键词】  体外循环；红细胞免疫；CD35抗原；CD59抗原；T淋巴细胞

 CD59 of  erythrocytes, and T lymphocytes immune.  METHODS  Eighteen cases of heart operation under ECC were included in this study. Venous blood samples were collected at pre-ECC, time of minimum body temperature, end of ECC, and 1 day, 3 days, 7 days after operation, then CD35 and CD59 on erythrocytes, and CD3, CD4 and CD8 on T lymphocytes were measured by flow cytometry immediately.  RESULTS  The CD35 positive erythrocytes(CD35+-E) percentage, geometric mean fluorescence intensity ratio of CD59(CD59-GMFIR) and CD35-GMFIR at time of minimum body temperature and end of ECC decreased, and the former two turned to recover to the level at pre-ECC, while CD35-GMFIR didn't have the same trend. CD35+-E percentage, CD35-GMFIR at end of ECC and 1 day after operation, and also CD59-GMFIR at time of minimum body temperature, end of ECC and 1 day after operation were lower than those at pre-ECC(P<0.01 or P<0.05), and all the indexes didn't return to the level at pre-ECC until 7 days after operation. The percentages of CD3 positive T lymphocytes(CD3+-T) and CD3+CD4+-T, and the ratio of CD4+-T/CD8+-T showed similar tendency as the indexes of red-cell immune from pre-ECC to 7 days after operation. The percentages of  CD3+-T and CD3+CD4+-T at time of minimum body temperature, end of ECC and 1 day, 3 days after operation were all lower than those at pre-ECC (P<0.01 or P<0.05), and returned to approach the pre-ECC level at 7 days after operation, while CD4+-T/CD8+-T ratio exceeded the pre-ECC level at that time.  CONCLUSION  CD35 and CD59 on erythrocytes, and T lymphocytes immune function decrease after ECC operation, the latter can recover at 7 days after operation, and the recovery period of the former is longer than that of the latter.

    Key words：  Extracorporeal circulation; Red-cell immune; CD35 antigen; CD59 antigen; T lymphocytes

    体外循环(extracorporeal circulation，ECC)是心内直视手术心脏疾病的一种重要手段。由于其是一非生理性循环，在ECC过程中，管路和氧合器材料、机械作用、氧合方式、温度应激等对血液成分的损害而引起炎性反应和免疫抑制是导致并发症的主要原因。红细胞占血液有形成分的99%以上，承担着呼吸和免疫两种功能，其免疫黏附能力占血细胞的85%以上［1］，在血液免疫中起重要作用。红细胞在ECC中受损最为严重，研究ECC对红细胞免疫分子及T淋巴细胞免疫的影响，比较二者变化趋势的异同，有助于探讨ECC导致免疫抑制的机制，为有效防治提供依据。

    1  资料与方法

    1.1  临床资料  心血管外科ECC手术病例18例，男10例，女8例，年龄19～71(45.6±16.2)岁。患者术前未使用过免疫抑制剂，无感染、肿瘤及自身免疫性疾病等致免疫低下的合并症。

    1.2  手术方法  采用静脉复合气管内全麻，常规正中开胸插管建立ECC。体内肝素化(3 mg/kg)。ECC采用膜式氧合器，浅低温，经升主动脉根部顺行灌注高钾冷血停搏液保护心肌，心脏停跳下行心内直视手术。ECC时间69～114(83.2±18.6)min，升主动脉阻断46～68(58.2±8.6)min。停止ECC后常规鱼精蛋白中和肝素。术毕患者入重症监护室。

    1.3  实验方法  于ECC前、体温最低点、ECC末及术后1 d、3 d、7 d分别采集患者静脉血于EDTA抗凝管中。① 红细胞CD35和CD59测定：EDTA抗凝血离心后，取5×105个红细胞/管，设同型对照管和测试管，分别加相应荧光标记抗体7 μl，室温避光30 min，PBS洗涤后重悬，用美国Becton Dickinson公司FACS Calibur流式细胞仪测试。CD35阳性红细胞(CD35+-E)百分率和单个红细胞CD35及CD59几何平均荧光强度比值(geometric mean fluorescence intensity ratio，GMFIR)(测试管GMFI/同型对照管GMFI)。② T淋巴细胞CD3、CD4和CD8测定：取100 μl EDTA抗凝全血，加5 μl CD45-FITC/CD4-PE/CD8-ECD/CD3-PC5混合标记抗体，按常规方法反应，用美国Becton Dickinson公司FACS Calibur流式细胞仪测试。分析CD3+-T、CD3+CD4+-T和CD3+CD8+-T百分率，计算CD4+-T/CD8+-T比值。

    1.4  统计学处理  应用SPSS 13.0统计软件计算各参数平均值和标准差，数据结果以平均值±标准差(±s)表示，采用F检验比较各时间点的差异，P＜0.05为有显著性差异。

    2  结  果

    2.1  红细胞CD35、CD59的动态变化  ECC前至ECC末，CD35+-E百分率、CD59-GMFIR和CD35 表1  红细胞CD35、CD59和T淋巴细胞免疫功能的动态变化（注：与ECC前比*P＜0.05,**P＜0.01

    -GMFIR均逐渐下降，前二者于术后1 d开始回升，而CD35-GMFIR未见明显恢复趋势。ECC末、术后1 d时CD35+-E百分率和CD35-GMFIR，以及体温最低点、ECC末和术后1 d时CD59-GMFIR均显著低于ECC前(P<0.01或P<0.05)。至术后7 d时，CD35+-E百分率、CD35-GMFIR和CD59-GMFIR仍未恢复至ECC前水平。见表1。

    2.2  T淋巴细胞免疫功能的动态变化  从ECC前至术后7 d，CD3+-T百分率、CD3+CD4+-T百分率、CD4+-T/CD8+-T均呈现先降低后升高的趋势，体温最低点、ECC末、术后1 d和术后3 d的CD3+-T百分率、CD3+CD4+-T百分率均显著低于ECC前(P<0.01或P<0.05)，至术后7 d恢复至接近于ECC前水平，而CD4+-T/CD8+-T比值则恢复至超过ECC前水平。见表1。

    3  讨  论

    自1981年Siegel提出红细胞免疫系统的概念后，人们先后发现红细胞表面和胞质中存在补体受体1(complement receptor type 1, CR1)、CR3、CD55、CD58、CD59、NK细胞增强因子、趋化因子受体等多种免疫相关物质，单独或联合发挥着免疫黏附、抗原递呈、直接杀伤等多种先天或获得性免疫功能。由于红细胞占血液有形成分的99%以上，其在血液免疫中的地位不容忽视。免疫黏附是细胞免疫的重要环节，红细胞和白细胞均具有黏附功能，其物质基础主要是存在于细胞表面的CR1(CD35)和CR3，尤以CD35为主，尽管单个白细胞表面CD35数量是单个红细胞表面CD35的3～30倍，但由于血液中红细胞数量是白细胞的500～1 000倍，红细胞的免疫黏附功能占绝对优势。红细胞对病原菌等异物的免疫黏附可以控制其随血液播散、便于红细胞分泌物质直接消灭以及将其递呈给白细胞彻底消灭，是红细胞免疫的基础环节，在红、白细胞免疫中发挥重要功能。郭峰［1］提出的血液免疫路线图理论认为红细胞是血液免疫的主干道形象地描述了红细胞免疫的重要作用。红细胞表面CD59则是T淋巴细胞表面CD2的配体，红细胞借助二者的结合将捕获的异物递呈给淋巴细胞启动特异性免疫反应。

    ECC是非生理性循环，氧合系统和循环管路对血细胞造成的生理性和功能性损害不可避免，而对红细胞的破坏重于白细胞。大量研究证实［2-5］，ECC对免疫细胞、细胞因子和炎性介质的数量和功能产生了巨大影响，诱发了手术后炎性反应和免疫抑制。由于对红细胞免疫的重要作用认识不足，目前尚缺乏ECC对红细胞免疫影响的详细研究，本研究利用流式细胞仪测定了ECC手术前后红细胞免疫分子CD35、CD59的动态变化，以CD35+-E百分率表示CD35+的红细胞数量占全部红细胞的百分率，以CD35-GMFIR反映红细胞表面CD35分子的平均密度；由于红细胞表面CD59密度极高，阳性率接近100%，ECC引起的变化对CD59平均密度影响较大，而对阳性率基本无影响，因此以CD59-GMFIR反映其分子数量的改变。同时，比较了手术前后红细胞免疫分子变化趋势与T淋巴细胞免疫功能变化的异同。

    研究结果显示，从ECC前至术后7 d，反映红细胞和T淋巴细胞免疫功能的多项指标均呈现先降低后回升的趋势，显示了免疫功能受损及损后修复过程。体温最低点、ECC末、术后1 d和术后3 d时，多项指标显著低于ECC前(P<0.01或P<0.05)，表明ECC手术使红细胞和T淋巴细胞免疫功能下降。除CD35-GMFIR至术后7 d仍无明显恢复迹象外，其他指标于术后1 d或3 d开始恢复，但直到术后7 d时，CD35+-E百分率、CD59-GMFIR仍未恢复至ECC前水平。而反应T淋巴细胞免疫状态的CD4+-T/CD8+-T比值以及淋巴细胞计数则均高于ECC前水平，表明T淋巴细胞的免疫状态可以在术后7 d完全恢复并在应激条件刺激下超过ECC前水平，而红细胞免疫分子CD35及CD59指标术后7 d仍不能恢复至ECC前水平则说明ECC手术对红细胞免疫系统打击较大，其损伤后修复较T淋巴细胞困难。此时，若有病原菌侵入血液中，红细胞捕获能力下降，导致病原菌在血液中移行和繁殖，不利于术后感染等多种并发症的防治。防止红细胞免疫功能下降是预防ECC手术术后感染等并发症的突破点之一，ECC仪器材料和手术方法的改进、调控红细胞免疫相关基因的表达等可能有助于缓解红细胞免疫功能及T淋巴细胞免疫功能下降。

【】
  ［1］ 郭峰. 血液免疫反应路线图理论 ［J］. 肿瘤学杂志, 2005, 11(3):157-158.

［2］ Franke A, Lante W, Kurig E,et al. Hyporesponsiveness of T cell subsets after cardiac surgery: a product of altered cell function or merely a result of absolute cell count changes in peripheral blood ［J］? Eur J Cardiothorac Surg, 2006, 30(1): 64-71.

［3］ Lehle K, Preuner JG, Vogt A,et al. Endothelial cell dysfunction after coronary artery bypass grafting with cardiopulmonary bypass in patients with type 2 diabetes mellitus ［J］. Eur J Cardiothorac Surg, 2007, 32(4): 611-616. ［4］ Gasz B, Lenard L, Racz B,et al. Effect of cardiopulmonary bypass on cytokine network and myocardial cytokine production ［J］. Clin Cardiol, 2006, 29(7): 311-315.

［5］ de Mendonca-Filho HT, Pereira KC, Fontes M,et al. Circulating inflammatory mediators and organ dysfunction after cardiovascular surgery with cardiopulmonary bypass: a prospective observational study ［J］. Crit Care, 2006, 10(2): R46-52.