低氧暴露下中性粒细胞过度激活与MODS发病的关系
【摘要】 高原缺氧状态下，机体应激所释放的各种细胞因子能够激活中性粒细胞，中性粒细胞活化后释放弹性蛋白酶等致炎因子，引起组织损伤，甚至导致多器官功能障碍综合征。因此，深入了解中性粒细胞激活与其释放的弹性蛋白酶在致机体损伤过程中的信号转导机制至关重要，以便进一步阐明中性粒细胞及弹性蛋白酶对MODS的诱导作用，为MODS的提供理论依据。
【关键词】 缺氧；中性粒细胞；中性粒细胞弹性蛋白酶；多器官功能障碍综合征
中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）是中性粒细胞(PMN)激活后释放的众多蛋白酶中最重要的一种。NE在机体的各种炎症反应、组织损伤过程中均起重要作用。多项研究表明，缺氧能够通过多种信号通路激活中性粒细胞释放弹性蛋白酶，进而破坏全身各内皮屏障间的紧密连接和基质蛋白，同时抑制PMN的正常凋亡，导致更多的NE释放和积聚，最终导致多个重要脏器损伤，甚至诱发多器官功能障碍综合征（MODS）[1]。高原环境下，由缺氧诱发的PMN过度激活进而导致MODS发生的现象在临床治疗中尤为明显，但其机制不清。因此，深入了解低氧暴露下PMN激活机制及其释放的NE在MODS发病中的作用尤为重要。现将这方面的研究进展综述如下。
1 NE的分子基础
NE是主要由中性粒细胞所释放的弹性蛋白酶, 其结构为218个氨基酸组成的单一肽链，相对分子质量大约25 900，含4个双硫键。其基因ELA2位于第19号染色体短臂末端1个56碱基对片段内，这个区域还包括丝氨酸蛋白酶和蛋白水解酶3基因，因此NE属于丝氨酸蛋白酶家族成员，与其他丝氨酸家族蛋白酶的同源性约为30％～40％[2]。酶的催化中心由3个氨基酸残基(组氨酸?41、天冬氨酸?88、丝氨酸?173)组成，空间位置相互靠近，均由发夹结构延伸到蛋白表面，其中丝氨酸残基侧链上的羟基具有很高的亲和性，并对低电荷的氨基酸具有高度的亲和性而易于与之结合，如缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、蛋氨酸等。以往实验结果表明，成熟的PMN中并无NE的mRNA表达，说明NE基因的高水平转录只限于早幼粒细胞阶段。NE合成后主要储存在PMN嗜苯胺蓝颗粒中，或者表达于被细胞因子初次激活的细胞表面，在嗜苯胺蓝颗粒内，NE的最高浓度可达5 mmol/L。
2 缺氧诱导PMN激活的分子机制
2.1 缺氧诱导中性粒细胞激活的胞外信号转导机制 缺氧状态下，PMN的激活主要是通过白细胞介素?8（IL?8）与细胞间黏附分子?1(ICAM?1)介导产生。IL?8是目前已知PMN最强的趋化因子和激活剂，有研究报道[3]，缺氧可使IL?8mRNA和蛋白质在巨噬细胞内表达显著增加。缺氧发生时，缺氧诱导因子?1α（HIF?1α）表达增强，HIF?1α通过作用于一系列细胞因子如：血管内皮生长因子、促红细胞生成素、诱导型一氧化氮合酶等引起缺氧代偿反应[4]。其中血管内皮生长因子的高表达可使血管通透性升高并诱导新生血管的形成，形成类似“炎症”反应。而IL?8可趋化PMN向炎症部位游走聚集，同时使血管内皮细胞表面表达黏附分子受体。并诱导细胞变形、脱颗粒反应、呼吸爆发和溶酶体内酶的释放而激活中性粒细胞[5]。
PMN与内皮细胞的黏附是导致中性粒细胞激活的另一重要因素，PMN与内皮细胞间的黏附作用主要分两个阶段[6]：第一阶段，即可逆性黏附阶段，此过程中PMN流动性减慢，滚动并黏附于血管内皮，为进一步黏附创造条件；第二阶段，即细胞间特异性识别阶段，其作用持久，此过程主要由ICAM?1及其受体介导。而Combe等[7]研究发现：培养的人肾小管细胞给予缺氧刺激后ICAM?1表达明显增高。提示缺氧可能是诱导ICAM?1高表达的重要影响因素。
2.2 缺氧诱导中性粒细胞激活的胞内信号转导机制 近年研究发现，PMN激活的分子内信号转导主要是通过PI3K/PKB信号通路实现的。PI3Ks是广泛存在机体各种细胞内的一种激酶，包括PI3Kαβδγ四种亚型，因其能使磷脂酰肌醇的肌醇环D23位置羟基发生磷酸化产生磷酸肌醇3磷酸(PIP3)而得名。PI3Ks是由一个110 kU 的催化亚基(P110)与一个调节亚基组成的异二聚体， 并根据其信号转导通路的不同而分为两类：Ia类的调节亚基是PI3Kαβδ，Ib类的调节亚基是PI3Kγ[8]。在PMN激活的信号转导过程中，主要是通过Ib PI3K介导的G2蛋白偶联的受体(GPCR)途径而起作用的。
当IL?8与PMN胞外的GPCR结合时，将导致G蛋白的Gα亚基与Gβγ亚基分离，释放的Gβγ与PI3Kγ结合后可活化PI3Kγ。活化的PI3Ks作用其胞膜上的脂质底物生成PIP3，PIP3即可与具有PH(pleckst rinhomology)结构域的多种蛋白激酶结合，从而使蛋白激酶聚集在胞内膜处并发生自我激活或被其他蛋白激酶激活，其中PKB是PIP3的主要结合蛋白。在同样具有PH结构域的磷脂酰肌醇依赖激酶1/2参与下，PKB上第473位的丝氨酸与第308位的苏氨酸发生磷酸化而被激活。激活的PKB可活化I?κB激酶，此酶可使与NF?κB结合并抑制其活性的I?κBα第23位的苏氨酸磷酸化而加速其降解，从而促使核因子NF?κB 发生核转位。同时PKB可使NF?κB的P65亚基磷酸化，增加其转录活性。PKB亦可活化CREB(cAMP反应元件结合蛋白)、活化蛋白?1(activator protein?1、AP?1)等转录因子，使其与相应的DNA调控区结合，与NF?κB共同影响相关基因的表达，从而激活PMN。
3 NE导致MODS发生的分子机制
PMN激活后可释放出大量的蛋白酶，如组织蛋白酶、胶原酶、NE等，其中NE是最重要的一种，也是破坏力最强的蛋白酶。近年有学者提出“中性粒细胞过度激活-多种细胞因子和炎症递质级联反应学说”[9]，认为PMN激活后释放NE和多种细胞因子，NE和细胞因子之间存在复杂的信号通路。这些通路相互交叉，彼此之间存在着协同作用，能够产生级联瀑布效应，使NE对气血屏障的破坏作用随时间延长而累积放大，不仅造成血液成分的漏出，而且会导致内毒素入血，最终引起MODS的发生。
3.1 通过与中性粒细胞的协同作用破坏内皮屏障 目前已知，PMN被激活的过程中，会发生向内皮细胞的聚集和黏附，这主要是由缺氧时PMN表面的黏附分子高表达与血管内皮细胞表面的黏附因子受体高表达而引起的。当PMN被激活后，大量的NE释放入血，入血的NE可以降解弹性蛋白、纤维蛋白、胶原、层黏连蛋白、氨基聚糖以及蛋白聚糖等细胞外基质组成成分，其最适底物为弹性蛋白，NE对细胞外基质的降解作用主要是通过激活明胶酶原B或直接破坏内皮细胞基底膜蛋白的途径发挥作用；NE还可通过增强PMN表面黏附分子的表达而增强PMN与内皮细胞的黏附作用。Yamaguchi[10]等在离体研究曾指出NE增强黏附分子表达的机制可能是通过钙离子内流和磷脂酶c信号转导的，而钙离子内流正是缺氧时组织细胞的广泛性表现之一。当内皮细胞间紧密连接的完整性被破坏后，黏附于内皮细胞的PMN就可能穿越血管内皮进入组织间隙，造成内皮细胞和组织器官的直接损伤；同时血管内皮损伤会使更多的PMN渗出，大量聚集的PMN又会释放更多的NE，使血管内皮损伤进一步加重。
另外，NE还可通过分解细胞外基质影响内皮细胞的形状，而许多细胞功能的发挥必须是在其特定的形状下才能正常进行。当内皮细胞形状改变后，其正常生理功能将受到损伤。
3.2 通过与氧自由基等炎症因子的协同作用破坏内皮屏障 NE可增强氧自由基的产生而损伤内皮细胞。氧自由基通过作用于内皮细胞脂质膜或膜蛋白而发生脂质过氧化反应，造成内皮细胞损伤。氧自由基产生的途径有很多种，近年来大量研究发现，PMN与内皮细胞的黏附作用和NE对细胞外基质的分解作用均可引起内皮细胞与细胞外基质解离、去黏附而产生氧自由基[11]，其机制可能是内皮细胞的去黏附作用导致内皮细胞线粒体呼吸爆发所产生的，Phan[12]等研究指出NE可使黄嘌呤脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶，用NE抑制剂可阻止这种转化，其他组织蛋白酶则没有这种特性，而黄嘌呤脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶是引起氧自由基产生的一个关键步骤，因此NE活性增强可导致氧自由基的产生增多，而使内皮细胞损伤加重。与此同时，增多的氧自由基又可以氧化NE内源性抑制剂α1抗胰蛋白酶活性中心的蛋氨酸残基而使之失活[13]，减轻对NE的抑制作用而加重NE对气血屏障的损伤。
NE还可增强IL?6、 IL?8、肿瘤坏死因子?α（TNF?α）等产生以及活化激肽、缓激肽、花生四烯酸等导致内皮细胞的损伤[14]，而这些炎性介质又能进一步激活单核巨噬细胞、淋巴细胞、PMN等活性细胞，形成细胞因子，并相互作用，产生细胞因子的级联瀑布效应。使炎症网络反应扩大，加重内皮细胞的损伤。
另外，有报道称NE属于金属蛋白酶类物质，可以通过激活基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)MMP?2、MMP?3、MMP?9和抑制金属蛋白酶的抑制剂?1（TIMP?1）而破坏蛋白分解平衡，间接加重蛋白酶类对内皮细胞外基质的分解作用[15]。
3.3 通过延迟PMN的凋亡时间破坏内皮屏障 正常PMN在成熟后的24 h 内启动凋亡控制程序，并很快死亡被吞噬细胞清除。因此血液中的PMNT1/2只有6～8 h。循环中的凋亡细胞被肝、脾巨噬细胞吞噬消化，而游走于组织中的凋亡细胞被邻近固有吞噬细胞清除，此过程均不诱发炎症反应。但在特殊条件下，如PMN短时间内在同一部位大量聚集，释放NE造成局部组织损伤和炎性反应时，PMN正常的凋亡过程可能受到阻碍而不能正常进行，结果导致PMN不能被及时清除并持续处于激活状态，释放更多的NE和细胞因子造成累积放大效应。同时大量积聚的NE和细胞因子将作用于周围组织细胞而增强某些特定细胞因子的表达或使之激活。这些细胞因子通过作用于PMN胞内的抑制凋亡信号转导通路而延缓PMN的凋亡时间，PMN凋亡时间的延迟，可使其存活时间延长，使毒性产物和氧自由基生成增多，引起原组织损伤的进行性恶化，最终导致MODS。
参与延缓中性粒细胞凋亡反应的细胞因子有很多，包括TNF?α、IL?1、IL?4、IL?6、IL?8、脂多糖（LPS）、腺嘌呤核苷、巨噬细胞集落刺激因子、糖皮质激素等[16]。NE主要通过诱导LPS入血和促进IL?8高表达而抑制PMN凋亡。当气血屏障的完整性被破坏后，LPS将通过破损处入血，继而诱发内毒素血症。入血的LPS可通过诱导CIAP?2(cellular inhibitor of apoptosis 2)mRNA和蛋白表达增加，高表达的CIAP?2蛋白酶可加速凋亡蛋白?3的降解，从而延缓中性粒细胞凋亡[17]；或者通过活化胞内酪氨酸激酶抑制PMN凋亡，此过程与LPS的浓度具有剂量依赖性；还可以通过p38MAPK信号转导通路呈剂量依赖性的抑制PMN凋亡[18]。体外实验中发现IL?8可激活PI3K/PKB的抗凋亡信号途径，活化的PKB使Bad(Bcl?2家族中的促凋亡成员)136位丝氨酸发生磷酸化，阻止其与DNA结合而影响凋亡蛋白的表达，并使Bad与抗凋亡蛋白Bcl?XL分离，解除对Bcl?XL的抑制作用。活化的PKB也可使caspase?9的196位丝氨酸磷酸化而抑制其作用[19]，并能抑制caspase?8与caspase?3的活化[20]，进而抑制凋亡的级联反应。
4 小结
PMN因其在体内的特殊地位和作用，对机体来说是一把“双刃剑”，正常时PMN能消灭外源性病原体、清除坏死组织、促进伤口愈合，是机体的“保护者”；但在某些病理条件下(如严重创伤、烧伤、缺氧、休克)，PMN过度激活却可阻塞微循环、损伤血管内皮细胞和血管外组织细胞、释放和促进释放炎症介质，成为“破坏者”，是导致MODS的重要原因。NE作为PMN释放的众多细胞因子中最重要的一种，对MODS的发病有着决定性的作用。PMN与其释放的NE在病理条件下，相互之间存在着众多复杂的信号转导通路。这提示我们可以通过阻断其信号转导通路的某一关键部分而减轻PMN及NE对组织的损伤作用。为临床新型药物的开发提供新的思路。
【】
[1] Maier RV. Pathogenesis of multiple organ dysfunction syndrome?endotoxin, inflammatory cells, and their mediators: cytokines and reactive oxygen species[J]. Surg Infect (Larchmt), 2000, 1(3): 197-204.
[2] 王 瑞，高向东.人中性粒细胞弹性蛋白酶及其抑制剂的研究[J].药学进展，2005，29(8)： 350-354.
[ 3] Galindo M,Santiago B,Alcami J,et al.Hypoxia induces expression of the chemokines monocyte chemoattractant protein?1 (MCP?1) and IL?8 in human dermal fibroblasts[J]. Clin Exp Immunol. 2001, 123(1): 36-41.
[ 4] Semenza GL, Shimoda LA, Prabhakar NR. Regulation of gene expression by HIF?1[J]. Novartis Found Symp. 2006, 272: 2-8.
[ 5] 罗荣华，姚 国，陶相光.缺氧缺血性脑病新生儿血清白细胞介素?8 水平的动态变化[J].厂矿医学，2004，17(5)：364-365.
[ 6] 周四桂，雷小勇，廖端芳.缺氧预适应对缺氧复氧诱导内皮细胞-中性粒细胞黏附的影响[J].中国危重病急救医学，2003，15(3)：159-162.
[ 7] Combe C, Burton CJ, Dufourco P, et al.Hypoxia induces intercellular adhesion molecule?1 on cultured human tubular cells[J]. Kidney Int. 1997, 51(6): 1703-1709.
[ 8] Cadwallader KA, Condliffe AM, McGregor A, et al. Regulation of phosphatidylinositol 3?kinase activity and phosphatidylinositol 3,4,5?trisphosphate accumulation by neutrophil priming agents[J]. J Immunol. 2002, 169(6): 3336-3344.
[ 9] 林 玲，方力争，王 琦.重症急性胰腺炎外周血中性粒细胞凋亡与多器官功能障碍综合征[J].中国实用外科杂志，2003，23(9)：552-553.
[10] Yamaguchi Y, Matsumura F, Wang FS. Neutrophil elastase enhances intercellular adhesion molecule?1 expression[J]. Transplantation. 1998, 65(12): 1622-1628.
[11] Li JM, Shah AM. Endothelial cell superoxide generation: regulation and relevance for cardiovascular pathophysiology[J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2004, 287(5): R1014-1030.
[12] Phan SH, Gannon DE, Ward PA, et al. Mechanism of neutrophil?induced xanthine dehydrogenase to xanthine oxidase conversion in endothelial cells: evidence of a role for elastase[J]. Am J Respir Cell Mol Biol. 1992, 6(3): 270-278.
[13] Perlmutter DH.Alpha?1?antitrypsin deficiency:diagnosis and treatment[J].Clin Liver Dis. 2004, 8(4):839-859.
[14] 李健权，苟大明，余志豪.弹性蛋白酶与体外循环中血管内皮细胞的激活/损伤[J].中国体外循环杂志，2007，5(2)：124-125.
[15] 陈平圣，陶冬英.基质金属蛋白酶抑制剂[J].医药卫生，2006，22(18)：2753-2754.
[16] 许 静，曹颜梅，李保春.细胞凋亡与SIRS和MODS[J].中华医药学杂志,2003，2(6)：27-29.
[17] Vassina EM, Yousefi S, Simon D, et al. cIAP?2 and survivin contribute to cytokine?mediated delayed eosinophil apoptosis[J]. Eur J Immunol. 2006, 36(7): 1975-1984.
[18] Nolan B, Duffy A, Paquin L, et al. Mitogen?activated protein kinases signal inhibition of apoptosis in lipopolysaccharide?stimulated neutrophils[J]. Surgery. 1999, 126(2): 406-412.
[19] Khreiss T, József L, Chan JS, et al. Activation of extracellular signal?regulated kinase couples platelet?activating factor?induced adhesion and delayed apoptosis of human neutrophils[J]. Cell Signal. 2004,16(7): 801-810.
[20] Klein JB, Rane MJ, Scherzer JA, et al. Granulocyte?macrophage colony?stimulating factor delays neutrophil constitutive apoptosis through phosphoinositide 3?kinase and extracellular signal?regulated kinase pathways[J]. J Immunol,2000,164(8): 4286-4291．
