牛大力多糖对免疫抑制小鼠的免疫调节作用

【摘要】  目的 探讨牛大力多糖对免疫功能低下小鼠的免疫调节作用。方法 采用环磷酰胺和荷瘤的方法建立免疫抑制小鼠动物模型，小鼠以灌胃的方法给予不同剂量牛大力多糖，利用MTT检测淋巴细胞转化及巨噬细胞吞噬中性红实验，分析牛大力多糖对免疫抑制小鼠的影响。结果 牛大力多糖可增强吞噬细胞的吞噬功能，增加抗体形成细胞的数量，促进淋巴细胞转化。结论 牛大力多糖明显具有增强小鼠免疫功能的作用，以高剂量组效果最为显著。

【关键词】  牛大力多糖；环磷酰胺；荷瘤；免疫调节

    Abstract： Objective  To investigate immunoregulatory activity of polysaccharide of Niudali (NDLS) on immunosuppressed mice.Methods  The models of immunosuppressed mice were established by treating with cyclophosphamide and tumor-bearing. Different doses of NDLS were orally administered to the mice. MTT method was used to observe the proliferation of lymphocytes and the function of macrophages in abdominal activity was also measured. Spectrophotometry was adopted to evaluate the ability of plaque forming cells.Results  NDLS enhanced the function of macrophage, increase the amount of plaque forming cells, and promote the proliferation of lymphocytes. Conclusion  NDLS can enhance the immunofunction of immunosuppressed mice.

    Key  words： polysaccharide of Niudali; cyclophosphamide; tumor-bearing; immunoregulation

    牛大力为豆科崖豆藤属植物美丽崖豆藤（Millettia specisoa Champ），以根入药，始载《花草药性备要》全年可采。以秋季挖根为佳。其性平，味甘，归肺、肾经。具有补虚润肺、强筋活络的功能，药理研究表明其对实验小鼠B淋巴细胞分泌特异抗体及T淋巴细胞产生白介素-2具有免疫调节作用［1］。但是对于牛大力的化学成分及其生物活性少有报道，本实验研究了牛大力多糖（NDLS）对环磷酰胺(Cy)和荷瘤所致免疫功能低下小鼠的免疫调节作用，以期为牛大力的开发研究提供基础依据。

    1  材料与方法

    1.1  药物  牛大力经南方医科大学中医药学院中药鉴定教研室陈兴兴鉴定，用无菌生理盐水配成所需浓度。

    1.2  试剂与仪器  （1）试剂：1640培养液、MTT、ConA均为Hyclone公司产品。Cy为上海第十二制药厂产品。（2）仪器：DG3022型酶联免疫检测仪，华东仪器厂；721型分光光度计，上海第三分析仪器厂生产；5%CO2培养箱(WJ-3A)，上海跃进医疗器械厂。

    1.3  动物  KIH种小白鼠50只，体重18~22 g，由南方医科大学实验动物中心提供，雌雄各半。

    1.4  实验方法

    1.4.1  分组及给药  KIH种小鼠50只，体重18~22 g，雌雄各半，随机分为对照组、模型组、NDLS低中高剂量组(100、200、400 mg/kg)，每组10只。对照组、模型组给予同容量的生理盐水，每天1次，连续10 d。

    1.4.2  造模［2］  于给药第4天 ip 60mg/kg Cy，建立免疫低下小鼠模型。无菌条件下抽取接种7 d 小鼠的腹水，用灭菌生理盐水1:3稀释，接种小鼠足趾皮下，0.2 ml/只，于接种后第2天开始给药，10 d 后处死小鼠，建立荷瘤小鼠模型。

    1.4.3  抗体形成细胞(PFC)的测定［3~4］  采用溶血分光光度法，于给药第4天 ip 5%新鲜无菌绵羊红细胞(SRBC)悬液0.2 ml 进行免疫，末次给药后1 h 处死小鼠，制备脾细胞悬液，取1×107脾细胞悬液、1:10豚鼠血清和0.2% SRBC各1 ml 混匀，37 ℃ 水浴1 h，离心取上清，用721分光光度计在560 nm 处测吸光度。

    1.4.4  淋巴细胞转化实验［5］  给药结束后处死动物，无菌取脾，制备脾细胞悬液。将同一组细胞悬液混合，调细胞浓度为5×106/ml，取150    μl 细胞悬液加入96孔培养板，并加入50 μl ConA(终浓度2 μg/ml)，置37 ℃ 5% CO2培养箱培养48 h，弃上清，加MTT 10 μl 孵育4 h，每孔加酸化异丙醇100 μl，用酶标仪在570 nm 处测定吸光度。

    1.4.5  腹腔巨噬细胞吞噬功能实验  无菌抽取荷瘤小鼠腹腔液，离心洗涤2次，用培养液将细胞浓度调至1.5×106/ml，于96孔板加细胞悬液200 μl，置37 ℃ 5% CO2培养箱过夜，取出，弃上清，每孔各加0.073%的中性红50 μl，继续培养30 min，弃中性红，用预温的PBS洗2次，再加细胞裂解剂，用酶标仪在540 nm 处测定吸光度。

    1.5  统计学方法  统计分析采用SPSS13.0软件，结果以均数±标准差表示，经方差齐性检验后行单因素方差分析，方差齐性时，采用LSD方法进行组间多重比较;方差不齐时，采用DunnettT3方法进行组间多重比较，以P<0.05定为差异有统计学意义。

    2  结果

    2.1  牛大力多糖对Cy处理小鼠脾淋巴细胞增殖能力与PFC的影响  实验结果表明牛大力多糖可明显提高Cy处理小鼠脾淋巴细胞无丝裂原的OD值、ConA的OD值和PFC的OD值，且与剂量呈正相关，详见表1。表1  牛大力多糖对Cy处理小鼠脾淋巴细胞增殖能力与PFC的影响

    2.2  牛大力多糖对荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖能力与PFC的影响  实验结果表明牛大力多糖可明显提高荷瘤小鼠脾淋巴细胞无丝裂原的OD值、ConA的OD值和PFC的OD值，且与剂量呈正相关，详见表2。表2  牛大力多糖对荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖能力与PFC的影响

    2.3  牛大力多糖对荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的影响  实验结果表明牛大力多糖可明显提高荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力，且与剂量呈正相关，详见表3。表3  牛大力多糖对荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的影响

    3  讨论

    机体的免疫功能与肿瘤的发生有密切关系。当宿主免疫功能低下或受抑制时，肿瘤发生率增高，而在肿瘤进行性生长时肿瘤患者的免疫功能受抑制，二者也互为因果［6］。

    植物多糖具有显著的免疫活性，尤其是在抗肿瘤方面疗效明确。Cy为较强的免疫抑制剂，它对多种免疫活性细胞均有抑制作用。肿瘤患者常伴有免疫功能低下及免疫器官萎缩。目前认为，机体的免疫功能降低有利于肿瘤的形成和发展。因此，本实验采用Cy和荷瘤的方法制备免疫功能低下的动物模型。结果显示，对照组和模型组实验指标差异具有统计学意义，说明本实验成功复制了实验动物模型。实验研究表明，NDLS可促进免疫抑制小鼠的IgM抗体的生成，增加抗体形成细胞的数量，促进B淋巴细胞增殖及分泌。NDLS对免疫抑制小鼠和由ConA诱导的脾T淋巴细胞转化能力低下的现象均有明显增强无丝裂原作用，并呈浓度依赖性的双向作用。

    机体免疫状态失常是肿瘤发生与发展的重要因素， 免疫功能抑制或紊乱，使肿瘤细胞能够逃避机体免疫系统对其的杀伤作用。肿瘤细胞分泌的可溶性免疫抑制因子可诱导免疫抑制细胞活化，进一步削弱机体整体的免疫功能， 因此肿瘤患者多表现不同程度的免疫功能减弱。目前已知针对多种病毒、肿瘤的细胞免疫是机体的重要防御因素［7~8］。提高肿瘤病人的免疫机能是肿瘤免疫的重要方面，此项研究为牛大力多糖提高肿瘤患者免疫功能提供了实验依据。该药具有药源充足、疗效显著、毒副作用小及不易产生耐药性等优点，具有广阔的应用前景。

【】
  ［1］ 吕世静,黄槐莲,吴宋厦.牛大力对抗体及IL-2产生的影响［J］.上海免疫学杂志,1997,17(1):56.

［2］ 戴伟娟,司瑞运,辛 勤,等.无花果多糖对免疫抑制小鼠的免疫调节作用［J］.中医药信息杂志,2002,9(3):23.

［3］ 徐叔云,卞如廉,陈 修.药理实验方法学［M］.第2版.北京:人民卫生出版社，1991：1228.

［4］ 熊平原.医学免疫学与微生物学实验教程［M］.第2版.南宁:广西师范大学出版社,1997：15.

［5］ 戴伟娟,索金良,林志彬.4-硒硫酸酯多糖体外给药的免疫药研究［J］.北京医科大学学报,1994,26(2):83.

［6］ Tsai JP, Chen HW, Cheng ML, et al. Analysis of host versus tumor interaction in cancer patients: opposing role of transforming growth factor2betal and interleukin26 in the development of in situ tumor immunity［J］. Imm unobiol.2005,210(9):661-671.

［7］ Tomas H, Veronica C, Neuman N,et al. Effective induction of HIV-specific CTL by multi-epitope using gene gun in a combined vaccination regime［J］. vaccine,1999， 17 :589-596.

［8］ Sin KQ,Hama JK,Sasaki S,et al. IL-15 expression plasmid enhances cell-mediated immunity induced by an HIV-1 DNA vaccine［J］. vaccine,1999,17:858-866.