胰蛋白酶在胰腺癌疼痛中的作用

                  作者：陆智杰，吴飞翔，缪雪蓉，俞卫锋 

【摘要】  目的 观察胰腺癌疼痛患者的胰腺肿瘤标本内胰蛋白酶的mRNA及其蛋白的表达。方法 取视觉模拟疼痛评分(VAS)在5分以上的胰腺肿瘤患者的新鲜组织标本，采用RT-PCR及ELISA的方法对胰蛋白酶的mRNA及其蛋白的表达进行检测。结果 胰腺癌组织中人胰蛋白酶 mRNA水平明显高于正常胰腺组织，ELISA显示胰腺癌组织的胰蛋白酶水平明显增高，与正常胰腺组织相比，差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 高水平的胰蛋白酶可能通过激活PAR-2介导胰腺癌疼痛的。

【关键词】  胰蛋白酶；胰腺肿瘤；疼痛；蛋白酶活化受体-2

    Abstract： Objective  To study the trypsin expression in pancreatic tumor specimen from pancreatic carcinoma patients with pain. Methods  RT-PCR and ELISA were used to identify trypsin mRNA and its expression in fresh tissue specimen from the pancreatic carcinoma patients with VAS (visual ache simulation) score ≥5. Results  The mRNA level was significantly higher in pancreatic carcinoma tissue than in nomal pancreatic tissue. And outcome of ELISA showed trypsin level of pancreatic carcinoma tissue significantly increased compared with that of nomal pancreatic tissue (P<0.05). Conclusion  High expression of trypsin is found in pancreatic carcinoma patients with pain, which may mediate nociception by activation of protease-activated receptor-2 in primary sensory neurons.

    Key  words： trypsin; pancreatic carcinoma; pain; protease-activated receptor-2

    1991—2000年来，胰腺癌病死率水平在不断上升，65岁以上人群尤为明显［1］。胰腺癌患者发生疼痛极为常见，胰腺癌患者的疼痛发生率及其严重程度与肿瘤程度相关，约30%~60% 病灶相对局限的早期胰腺癌患者和逾80%的进展期胰腺癌患者有癌痛体验，患者死亡前的癌痛发生率更高达90%。

    胰蛋白酶(Trypsin)为蛋白酶的一种，在胰脏是作为酶的前体胰蛋白酶原而被合成的，是肽链内切酶，它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断。它不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其他酶的前体，起活化作用。胰蛋白酶还可激活蛋白酶活化受体-2(protease-activated receptor，PAR-2)，近年来，发现蛋白酶活化受体-2可能介导胰腺炎的疼痛［2］，给清醒大鼠胰管内注入胰蛋白酶和PAR-2特异性肽激动剂均可以引起疼痛行为反应。在胰腺炎症时，胰腺组织胰蛋白酶可激活PAR-2，在胰腺癌发生时，是否同样具有蛋白酶的高表达呢？为此，我们选取东方肝胆外科确诊的胰腺癌病例，视觉模拟疼痛评分(VAS)在5分以上的胰腺肿瘤患者的新鲜组织标本，对胰蛋白酶的mRNA及其蛋白的表达进行检测，以验证胰蛋白酶是否高表达，并激活PAR-2引起胰腺癌疼痛。

    1  材料与方法

    1.1  实验材料  选取人胰腺癌患者的肿瘤新鲜组织。人胰蛋白酶ELISA试剂盒为武汉中美科技有限公司产品。考马斯亮蓝试剂盒为南京建成生物工程研究所产品。RT-PCR试剂盒为德国Qiagen公司产品。Tag酶为美国BioLabs公司产品。

    1.2  标本的选取及分组  分为两组，实验组10例为胰腺癌组，视觉模拟疼痛评分(VAS)在5分以上；对照组10例为正常胰腺组织组。

    1.3  RT-PCR方法检测人胰蛋白酶mRNA的表达  人胰蛋白酶基因序列(NM-002771.2)由Gene bank获得，据其序列特点，设计引物序列如下：5-CATGTTCTGTGTGGGCTTCCT-3 ；5-GTAGACCTTGGTGTAGACTCC-3。取预标本匀浆，加入Trizol 试剂1 ml，振荡15 s 混匀后，加入酚200 μl，混匀，加入氯仿：异戊醇溶液200 μl，混匀。4 ℃，15 000 r/min 离心10 min，抽取上清入新管；加入400 μl 氯仿：异戊醇溶液，混匀后4 ℃，15 000 r/min 离心10 min，抽上清入新管，用500 ml 异丙醇室温下沉淀10 min，4 ℃，15 000 r/min 离心10 min，弃上清，用70%乙醇溶液1 ml 清洗2次，溶解于Milliq 水50 μl 中，分光光度计检测浓度和纯度-80 ℃ 低温保存。而后以上述引物行RT-PCR，解链温度为54 ℃，进行30个循环。

    1.4  ELISA检测人胰蛋白酶水平的变化  取正常胰腺组织及胰腺癌组织，匀浆后考马斯亮蓝测定总蛋白，采用双抗体夹心ABC-ELISA法检测，将抗人胰蛋白酶单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的人胰蛋白酶与单抗结合，加入生物素化的抗大鼠人胰蛋白酶，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入酶底物OPD，出现黄色，加终止液硫酸，颜色变深，在450 nm 处测OD值，人胰蛋白酶浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中人胰蛋白酶浓度。

    1.5  统计学方法  计量资料以均数±标准差表示，用SAS 6.12统计软件进行分析，数据比较均采用近似F检验（SNK-q），P<0.05具有统计学意义。

    2  结果

    2.1  手术标本的选取  成功获取人胰腺癌组织标本10例，其中7例病理为胰头腺癌，3例为胰体尾腺癌。所有患者视觉模拟评分（visual analogue scale，VAS）>5分。另获取对照组正常胰腺组织标本10例。

    2.2  RT-PCR方法检测人胰蛋白酶mRNA的表达  RT-PCR测定人胰蛋白酶 mRNA水平，可扩增出134 bp 的序列，如图1所示。胰腺癌组织中人胰蛋白酶 mRNA水平明显高于正常胰腺组织。

    图1  RT-PCR示胰腺及胰腺癌组织中胰蛋白酶 mRNA水平

    2.3  ELISA检测人胰蛋白酶水平的变化  ELISA测定的标准曲线方程为y=176.55x -0.623 6，相关系数R2=0.998 1，具有良好的相关性。标准曲线如图2所示。

    根据所测的OD值及标准曲线，对胰腺癌及正常胰腺组织的胰蛋白酶值进行，胰腺癌组织的胰蛋白酶水平明显高于正常胰腺（P<0.05）。详见表1（因胰腺癌组有3例胰腺组织坏死，未能检测，故测了7例。为方便比较，正常组也测了7例）。表1  胰腺癌与正常胰腺组织中胰蛋白酶水平比较

    3  讨论

    胰腺癌的腹痛表现多种多样，并可在胰腺癌病程及诊治过程中发生变化。典型腹痛表现为上腹部疼痛，腹痛性质常见上腹钝痛、阵发性剧烈上腹痛和涉及腰背部的上腹痛。本研究所选择的方法，多是以上腹痛为首发症状［3］，视觉模拟疼痛评分(VAS)都在5分以上。晚期胰腺癌疼痛相当剧烈，不仅为躯体方面的疼痛，而是涉及社会、心理和精神方面的全方位疼痛，常伴有强烈的自主神经系统和心异常，部分患者对癌痛的恐惧甚至超过对死亡的恐惧。因此，癌痛控制已成为患者的第一需要和构成胰腺癌姑息不可缺少的重要组成部分。

    胰蛋白酶为蛋白酶的一种，而在胰腺癌的患者中，半数以上出现胰蛋白酶增高。肿瘤侵犯正常胰腺，可导致胰蛋白酶被激活。此外肿瘤组织中也可能分泌其他能够激活PAR-2的蛋白酶。因此，肿瘤组织完全有可能通过这些蛋白酶直接激活初级传入感觉神经元，继而将伤害性感受信号逐级传递到中枢，这很可能是胰腺癌疼痛的重要的发生和维持机制之一。在本研究中，通过ELISA及RT-PCR方法对胰腺癌组织中胰蛋白酶及其mRNA水平进行测定，发现胰腺癌组织中胰蛋白酶及其mRNA水平明显高于正常胰腺组织（P<0.05），这说明胰腺癌发生时胰蛋白酶的水平及蛋白水解酶的活性都明显升高，这可能与胰腺癌的发生有关。但同时，也促进胰蛋白酶及蛋白水解酶与PAR-2结合，激活PAR-2，通过细胞内的信号转导，传递痛觉信号，导致胰腺癌疼痛的发生。这与Kayssi等［4］在结肠的研究中一致，认为胰蛋白酶及PAR-2以自分泌、正反馈的方式在促进肿瘤增生的同时，也激活了MAPK-ERK通路，同时抑制了IK电流，从而使DRG神经元处于高兴奋状态，维持长期的内脏痛。

    胰蛋白酶是最有效的PAR-2激活剂［5］，可激活胰腺导管上皮细胞的PAR-2。活化的PAR-2可通过磷酸肌醇、酪氨酸磷酸化、蛋白激酶C、Ca2+等介导细胞内信号转导，近年来研究主要集中在细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)转导途径［6~7］。PAR-2激活剂能经多种途径激活ERK1/2，ERK1/2激活后可使细胞骨架蛋白、微管相关蛋白和磷脂酶A2磷酸化，启动多种细胞质反应，ERK还可通过激活cAMP 反应元件结合蛋白(cAMP response element　binding protein，CREB)，以CREB依赖性的方式调控下游基因的表达，包括c-fos、NK-1、强啡肽和BDNF等［8］。在大鼠CCI的神经病理性疼痛模型中，鞘内注射ERK抑制剂U0126或ERK反义寡核苷酸可减弱机械性的超敏和痛觉过敏，这说明ERK信号通路与CCI诱导的神经病理性疼痛有关［9］。因此，蛋白水解酶-PAR-2-ERK-CERB信号转导通路可能是胰腺癌引起长期疼痛的可能机制。

    总之，本研究通过对胰腺肿瘤疼痛患者胰蛋白酶水平进行测定，发现在胰腺癌组织中胰蛋白酶及其mRNA的水平增高，可激活PAR-2，可能通过PKC、ERK等通路，介导疼痛的发生。

【】
  ［1］ 王 丽, 杨攻焕, 李 辉,等. 1991—2000年胰腺癌病死率的变迁［J］. 中华内科杂志, 2005, 44: 509-513.

［2］ Hoogerwerf WA, Shenoy M, Winston JH, et al. Trypsin mediates nociception via the proteinase-activated receptor 2: a potentially novel role in pancreatic pain［J］. Gastroenterology, 2004,127:883-891.

［3］ 王成锋，赵平重.胰腺癌的预防和早期诊断［J］. 国际外杂志,2007,34(9):584-587.

［4］ Kayssi A, Amadesi S, Bautista F, et al. Mechanisms of protease-activated receptor 2-evoked hyperexcitability of nociceptive neurons innervating the mouse colon［J］. Physiol, 2007, 580: 977-991.

［5］ 窦勇鹰,谢立群,李俊美,等.蛋白酶激活受体的研究进展［J］.世界华人消化杂志, 2006,14(12):1206-1209.

［6］ Ethier C, Labelle Y, Poirier GG.PARP-1-induced cell death through inhibition of the MEK/ERK pathway in MNNG-treated HeLa cells［J］. Apoptosis,2007,12(11): 2037-2049.

［7］ Ritchie E, Saka M, Mackenzie C, et al.Cytokine upregulation of proteinase-activated-receptors 2 and 4 expression mediated by p38 MAP kinase and inhibitory kappa B kinase beta in human endothelial cells［J］.Br J Pharmacol,2007，150(8): 1044-1054.

［8］ Yasuhiko K, Tatsuro K, Zhi-Ye Z. Ionotropic and metabotropic receptors, protein kinase A, protein kinase C, and Src contribute to C-fiber-induced ERK activation and cAMP response element-binding protein phosphorylation in dorsal horn neurons, leading to central sensitization［J］. J Neurosci, 2004, 24:8310-8321.

［9］ Song XS,Cao JL,Xu YB,et al.Activation of ERK/CREB pathway in spinal cord contributes to chronic constrictive injury-induced neuropathic pain in rats［J］. Acta Pharmacol Sin, 2005, 26:789-798.