糖基化终产物对人单核细胞EMMPRIN基因表达的影响

【摘要】  目的：探讨糖基化终产物（AGEs）对人单核细胞细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（EMMPRIN）表达的影响。方法：在培养的人单核细胞株中分别加入不同浓度AGEs干预24 h和同一浓度AGEs干预不同的时间点，以1640培养基和相应浓度的牛血清白蛋白为对照组。用逆转录聚合酶链反应检测EMMPRIN mRNA的表达水平。结果：AGEs干预人单核细胞的EMMPRIN mRNA水平与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）；且其表达呈时间和浓度依赖性降低（P＜0.05）。结论：AGEs以时间及浓度依赖的方式减少人单核细胞EMMPRIN mRNA的表达。

【关键词】  糖基化终产物； 人单核细胞； 细胞外基质金属蛋白酶诱导因子； 逆转录聚合酶链反应； 糖尿病

    [Abstract]   Objective：To investigate the effects of advanced glycosylation end products （AGEs） on the expression of extracellular matrix metalloproteinase inducer（EMMPRIN） in cultured human monocytes. Methods：The cultured human monocytes were incubated with AGEs （50，100，200，400 mg·L-1） for 24 h or 200 mg·L-1 AGEs for 8、16、24 and 48 h respectively，which were incubated with 1640 medium and BSA as a control. The mRNA expression of EMMPRIN in human monocytes was analyzed by RT-PCR. Results：Compared with that in cells incubated with 1640 and BSA， the level of EMMPRIN mRNA in cells treated with AGEs decreased significantly in a concentration-dependent and time-dependent manner. Conclusion：The AGEs inhibit the expression of EMMPRIN in cultured human monocytes.

    [Key words]   Advanced glycation end products； Human monocytes； Extracelluar matrix metalloproteinase inducer；Reverse transcriptase polymerase chain reaction；Diabetes mellitus细胞外基质（extracellular matrix，ECM）

    在血管周围及其它组织的积聚是糖尿病慢性血管并发症的主要病理机制之一。细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer， EMMPRIN）能刺激细胞外基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase， MMPs）如MMP-1、MMP-2、MMP-3、膜型基质金属蛋白降解酶（MT-MMP）的表达，从而影响细胞外基质的转归。本研究以人单核细胞为研究对象，观察糖基化终产物（advanced glycosylation end products，AGEs）对人单核细胞EMMPRIN基因表达的影响。有助于说明AGEs通过EMMPRIN增加细胞外基质的积聚，从而参与糖尿病慢性并发症的发生。

    1   材料与方法

    1.1   材料   牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA，AMRESCO产品）；1640培养基（Gibco公司）；胎牛血清（浙江省杭州四季青公司）；DNA Ｍarker DL2000，天为时代公司）；EMMPRIN及GAPDH引物由上海生工合成；其他试剂均为国产分析纯。

    1.2   方法

    1.2.1   AGE-BSA的制备   BSA浓度为5.0 g·L-1，葡萄糖浓度为50 mmol·L-1，充分溶解于pH7.4 PBS后，过滤除菌，37 ℃无菌避光孵育90天。PBS溶液透析去除未结合的葡萄糖。同样条件制备不含葡萄糖BSA作为阴性对照。荧光光谱扫描分析鉴定AGEs。其激发波长370 nm、发射波长440 nm、狭缝为3 nm。

    1.2.2   细胞培养及干预实验   人单核细胞（U937）用含10%胎牛血清的1640培养液，置37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。将细胞接种于六孔板中，每孔1×104个细胞，待细胞达到次融合状时，换用无血清的培养液饥饿24小时后，分组进行干预，以1640组和BSA组（200 mg·L-1）为对照组，每组两个复孔。加入不同浓度的AGEs（50、100、200、400 mg·L-1）干预细胞， 24小时后收集细胞；以200 mg·L-1的AGEs分别干预细胞8、16、24、48小时，以1640组和BSA组（200 mg·L-1）为对照组，每组2个复孔。

    1.2.3   RT-PCR检测单核细胞的EMMPRIN mRNA的表达   采用Trizol法提取各组细胞的总RNA，经紫外分光光度计测定RNA的OD260与OD280在1.60~1.80，1%的甲醛变性凝胶电泳证实总RNA的完整性较好（28s与18s两条电泳带吸光度比值等于1.8∶1.0）。

    立即取2 μg总RNA为模板逆转录，根据，由上海生工公司合成EMMPRIN和GAPDH单核苷酸引物。EMMPRIN上游：5’-GGCCAGAAAACGGAGTTCAA-3’，下游：5’-GCGCTTCTCGTAGATGAAGA-3’；GAPDH上游：5’-GGAGTCAACGGATT TGGT-3’，下游：5’-GTGATGGGATTTCCATTG AT-3’。用这两对引物可扩增出长度约为492 bp的EMMPRIN CDNA片段及长度约为206 bp的GAPDH CDNA片断引物合成后用去RNA酶水溶解，工作浓度为10 mol/L。选择PCR的循环数28，保证PCR产物在线性增加范围内。

    PCR反应体系为50 μl（10×Buffer 4 μl、25 μM MgCl2  4 μl、cDNA 4 μl、2.5 mmol/L dNTP 2 μl目的序列上下游各1 μl，GAPDH序列上下游各1 μl，水31.5 μl，Taq酶0.5 μl）反应条件:94 ℃ 2 min预变性，然后94 ℃ 1 min、72 ℃ 2 min进行28个循环扩增，再以72 ℃延伸8 min。

    PCR产物的检测和分析：5 μl PCR产物和1 μl 6×上样缓冲液进行2％琼脂糖凝胶（含0.5 mg/L溴化乙锭）100 V恒压电泳40 min，用GelDoc-It imaging system凝胶成像处理系统对每一样品PCR产物扩增的特异性片段（EMMPRIN和GAPDH）进行密度扫描分析，以GAPDH密度作为定量标准，数值以两者之积分吸光度的比值表示。

    1.3   统计学方法   所有数据用■±s表示，采用SPSS12.0软件分析数据，组间差异采用方差分析，P<0.05示差异有统计学意义。

    2   结      果

    2.1   不同浓度AGE-BSA干预单核细胞后EMMPRIN mRNA的表达   U937在1640组EMMPRIN有高表达，其与GAPDH的吸光度比值为1.551±0.060，BSA组1.607±0.058。50、100、200、400 mg·L-1 AGE-BSA干预后，EMMPRIN与GAPDH吸光密度比值，较BSA组和1640组表达显著减少（P＜0.05），依次为1.348±0.048、0.923±0.041、0.779±0.052、0.499±0.038（见图1）。

    2.2   200 mg·L-1AGE-BSA干预U937不同时间点EMMPRIN基因的表达   用浓度为200 mg·L-1的AGE-BSA干预U937 8、16、24、48 h，在干预8 h U937的EMMPRIN mRNA即已降低，与1640组相比，P＜0.05；且随培养时间的延长，EMMPRIN的表达逐渐地降低（P＜0.05）。各组EMMPRIN与GAPDH吸光密度比值依次的光密度比值分别是：1640组：1.665±0.054，BSA组：1.624±0.061，8 h：1.373±0.046，16 h：1.098±0.038， 24 h：0.860±0.042，48 h：0.663±0.032（见图2）。

    3   讨      论

    AGEs在糖尿病慢性并发症的形成过程中起着重要的作用，它能与蛋白质呈不可逆的联结，导致基质的增生，沉积于组织间质和血管壁，致血管管腔的狭窄及血栓的形成，最终影响器官的结构和功能。其中，AGEs降低了基质金属蛋白的合成、分泌及活性，在糖尿病慢性并发症发生的中发挥重要作用。

    EMMPRIN，一种高度糖基化黏附蛋白，分子量大小范围50~60 kD，又称CD147、Basigin、M6，分布于多种细胞中，包括肾小管上皮、肾系膜细胞、单核细胞等[1]。其增加成纤维细胞、单核细胞基质金属蛋白酶表达，参与细胞外基质的降解，从而参与多种病理和生理过程[2]。

    AGEs可诱导单核细胞激活和趋化，并转移至血管周围，导致微血管炎症，且AGEs可增加肿瘤坏死因子-α、IL-1等细胞因子的表达和分泌，而研究表明各种炎症因子如肿瘤坏死因子-β、IL-6等刺激EMMPRIN、基质金属蛋白在动脉粥样硬化斑块纤维帽中表达，控制了斑块的稳定性[2]；单核-巨噬细胞一方面通过局部炎症反应在糖尿病肾病发病中起重要作用，另一方面，可能存在对血管管腔基质的MMPs/TIMPs的影响而促进糖尿病慢性并发症的发展。

    EMMPRIN通过影响基质金属蛋白酶而参与细胞外基质的降解，从而影响了糖尿病慢性血管并发症的发展。有研究表明，有糖尿病的较无糖尿病患者的动脉（取自冠脉搭桥手术后的内乳动脉）中EMMPRIN、MT-MMP表达明显降低，且基质金属蛋白酶活性明显降低。说明EMMPRIN参与糖尿病患者血管的基质病理性重建[3]。而本实验组前面研究已证明了AGEs能显著降低肾系膜系胞的MMP2及EMMPRIN的表达[4]，说明了EMMPRIN通过基质金属蛋白调节糖尿病肾病患者的细胞外基质增殖，从而参与了糖尿病肾病的发展。

    本实验中我们发现，随着AGEs浓度的增加，各组人单核细胞EMMPRIN mRNA的表达降低；另外，用敏感浓度的AGEs干预各组人单核细胞不同时间，各组细胞EMMPRIN mRNA的表达也相应降低。这证实了AGEs以浓度及时间依赖的方式减少人单核细胞EMMPRIN mRNA的表达。AGEs通过降低人单核细胞EMMPRIN基因的表达，可能影响细胞外基质金属蛋白酶的活性，从而调节微血管周围及组织间质的基质，可能影响糖尿病慢性血管并发症的发生发展。研究AGEs是否通过EMMPRIN影响细胞外基质在糖尿病微血管周围的积聚可为糖尿病慢性并发症的发生发展提供新的靶点，并为糖尿病慢性并发症的提供新的实验室依据。

【参考】
  [1] Deora AA， Philp N， Hu J， et al. Mechamism regulating tissue-specific polarity of monocarboxylate transporters and their chaperone CD147 in kidney and retinal epithelia[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2005，45（5）:16245-16250.

[2] Yoon YW， Kwon HM， Hwang KC， et al. Upstream regulation of matrix metalloproteinase by EMMPRIN（extracellular metrix metalloproteinase inducer）in advanced atherosclerotic plaque[J]. Atherosclerosis， 2005，180（1）: 37-44.

[3] Portik-Dobos V，Anstadt MP，Hutchinson J，et al. Evidence for a matrix metalloproteinase induction/activation system in arterial vasculature and decreased synthesis and activity in diabetes[J]. Diabetes， 2002，51（10）: 3063-3068.

[4] 魏 娟， 孙子林，杨 涛， 等． 糖基化终产物对人肾小球系膜细胞细胞外基质金属蛋白酶促进因子基因表达的影响[J]. 江苏医药，2007，33（5）：483-485.