单管多重PCR鉴定HPV基因型方法的建立和临床评价

                 作者：曾凡杞，张志云，李永双，冉灵芝

【摘要】  目的 建立单管多重PCR鉴定低危和高危乳突瘤病毒(HPV)的方法以及用临床标本对该方法进行评价。方法 设计HPV基因型特异的引物，在一个PCR反应管中PCR扩增来自上皮细胞提取的DNA，然后用毛细管电泳对PCR产物进行分离，根据扩增产物的大小确定相应的HPV基因型。对不同病理期的1094份临床宫颈标本和对照进行了分析。结果 一共鉴定了16个HPV基因型，即HPV16, 58, 52, 51, 56, 31, 18, 39, 66, 59, 6, 33, 30, 35, 45和11。该方法具有高度的灵敏性和可重复性。同对照相比，未知重要意义的非典型鳞状细胞(ASCUS)、低级别表皮内损伤(LSILs)、高级别的表皮内损伤(HSILs)标本HPV检出阳性率分别为60.5%、77.1%和82.2%，而对照为14.4%，其中在HSILs标本HPV16和HPV58检出率最高，并与细胞恶性程度呈正相关。结论 单管多重PCR鉴定HPV的方法是稳定的，且可以用于HPV的流行病学的调查。

【关键词】  乳突瘤病毒;基因型;多重PCR;毛细管电泳

　　ABSTRACT：Objective To develop a method for identification of human papillomaviruses by multiplex PCR in a single PCR tube and to evaluate this method.Methods Multiplex PCR was based on the amplification of HPV DNA by sets of HPV genotype?specific primers,and the genotypes of HPV were visually identified by the sizes of amplicons after they were separated by capillary electrophoresis.We conducted a pilot study to examine the correlation between the prevalence and genotype distributions of HPV and the cytological group classifications for 1094 cervical samples.Results We detected all 16 HPV genotypes (types 16,58,52,51,56,31,18,39,66,59,6,33,30,35,45and11) with a high sensitivity and a high degree of reproducibility.Compared with the group of samples considered normal(14.4%),there was a significant increase in the prevalence of HPV in women with atypical squamous cells of unknown significance(ASCUS)(60.5%),low?grade intraepithelial lesions(LSIL)(77.1%),and high?grade intraepithelial lesions(HSILs)(82.2%).The prevalence and distribution of type 58 were correlated with cytological malignancies,with the highest prevalence in women with HSILs.Conclusion The novel multiplex PCR method described appears to be highly suitable not only for the screening of cervical cancer precursor lesions but also for the characterization of genotype distributions in large?scale epidemiological studies

　　KEY WORDS：Human papillomaviruses;Genotype;Multiplex PCR;Capillary electrophoresis

　　HPV家族有100多个基因型，其中30～40个感染黏膜，至少15个HPV基因型与宫颈癌的发生密切相关。宫颈细胞巴氏染色检查使宫颈癌的发病率和死亡率大大下降，如果HPV的DNA检查和巴氏检查联合使用，对于因感染高危型HPV可能宫颈癌的诊断非常有意义。本研究旨在建立单一PCR管，用HPV特异性引物多重PCR方法扩增，然后用毛细管电泳分离PCR扩增产物，根据其大小确定相应的HPV基因型，并用该方法评估不同病理标本，了解这些标本中的HPV基因型分布。

　　1 材料和方法

　　1.1 标本收集和细胞学检查

　　从我院皮肤性病科、妇产科门诊收集宫颈标本，将标本保存在LBC培养基中。每组的平均年龄和细胞学诊断与HPV阳性、多重感染的相关性见表1。用细胞刷收集宫颈内外的宫颈细胞，标本保存在10ml的cytoRich或18ml preserveCyt保存培养液中。Pap?染色的LBC标本进行细胞学检查。细胞涂片根据Bethesda系统分类：正常细胞、未知重要性的非典型鳞状细胞(ASCUS)、低和高级别的表皮内损伤(LSILs 和HSILs)。细胞涂片剩下的细胞4℃保存，以便提取DNA。在未知HPV基因型之前进行细胞学诊断。1094份标本中，584份标本是正常的，124份有ASCUS，240份被认为是LSILs，146份是HSILs。表1 细胞学诊断与HPV阳性、多重感染的相关性

1.2 DNA的提取

　　保存在培养液的细胞以13000rmp,离心15min, 细胞用PBS重悬后，再离心。用蛋白酶K在56℃孵育，苯酚氯仿抽提，酒精沉淀，然后用TE溶解，DNA的浓度用分光光度计在260nm处进行分析。

　　1.3 HPV序列

　　从GenBank获得不同HPV分离株的完整基因组用于引物的设计。用Genetyx software (version 7.03;Genetyx Corporation,Tokyo,Japan)对不同HPV基因型进行比对。用HPV基因特异性引物PCR和PCR产物测序。16个HPV基因型(HPV6, 11, 16, 18, 30, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59和66)在单个PCR管用多重PCR进行检测。PCR产物用毛细管电泳分析相应的HPV基因型。

　　1.4 统计学分析

　　用Fisher's exact test 软件包进行分析，P<0.05认为有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 特异引物的设计

　　为了研究HPV感染、基因型分布、多重感染与宫颈癌癌前病变之间的关系，我们设计了17对基因型特异性引物，能够扩增16型HPV DNA的特定区域。这些引物的设计满足下列标准：①引物的3'端含错配碱基确保基因特异的扩增。②引物的熔解温度应该高于65℃，增加PCR扩增的特异性。③除了少数引物外，引物中GC含量在45%～60%之间。④每个扩增产物的大小至少应该有20 bp的差异，便于用毛细管电泳进行鉴定。⑤引物不应该与人类基因组DNA退火。具体HPV基因型特异性引物见表2。同时，为HPV16设计了一对额外的引物以确保对它的鉴定准确，因为HPV16是已知宫颈癌最常被检测的基因型。

　　2.2 多重PCR的特异性

　　多重PCR在一个终体积为50μl PCR管中操作。每个PCR混合液中含25μl Qiagen多重PCR母液，5μl模板DNA，5μl去离子水，和5 nM整个引物。反应条件为Qiagen Taq在95℃ 15 min，随后在94℃ 30s, 70℃ 1.5min 退火,72℃延伸1min，循环数为40，最后在72℃延伸2min。用Aminolevulinate deltasynthase1(GenBank accession no.NM 000688)作为内参阳性对照，而来自Brevundimonas diminuta DNA片段克隆到质粒pCRII?TOPO(Invitrogen Corporation)作为阴性对照。2μl扩增产物在含EB的1.5%琼脂糖凝胶电泳进行分析。被扩增的DNA用QIAquick回收试剂盒纯化后测序。用BLAST比对分析证实。HPV基因型的标准快速检测，最终的扩增产物被分离，用2100生物分析仪分析(Agilent Technologies Inc.,Palo Alto,CA)。HPV基因型通过扩增产物的大小进行鉴定。HPV58产生单一的主带和邻近的次带，经测序分析均为HPV58。所有其他的HPV型产生单一的条带，每个型别对应特定的大小。

　　2.3 多重PCR的敏感性

　　通过检测HPV16、HPV58两个不同分离的条带，所有其他的单一带型对它们的基因型进行鉴定。是否多重感染通过确定条带的大小进行鉴定。检测限通过质粒的系列稀释进行确定。对所有16个HPV基因型，当质粒的含量超过102拷贝，便可检测HPV特异的条带。表2 HPV多重PCR特异性引物序列

　　F:正向引物; R:反向引物; Tm:解链温度; IC;内控; EC:外控2.4 细胞病理分析与HPV感染的相关性

　　每个病理分组标本中HPV感染的发生率见表1。在这些标本中，病理分析是正常的标本，HPV阳性为14.4%(84/584)。HPV感染的发生率随着病理异常而显著增加：ASCUS 60.5%， LSILs 77.1% ，HSILs 82.2%。因此，HPV感染的发生同细胞病理异常成正相关。同正常的细胞病理标本相比(3.4%)，随着细胞病理异常增加，多重感染率也显著增加，ASCUS(27.4%)，LSILs(20.0%)和HSILs(32.9%)。因此，多重感染的发生率同细胞病理异常也呈正相关。值得注意的是，ASCUS显示第二高的发生频率。这可能因为是将含有koilocytes的标本也归于ASCUS的结果。

　　2.5 基因型的分布与细胞病理的关系

　　在正常病理组，HPV16的发生率最高(31.0%)，然后依次为HPV52(19.0%)， HPV51(16.7%)， HPV58和HPV18(14.2%)，HPV66和HPV59(7.1%)，HPV31(9.5%)，和HPV56、39、6、33和45(2.3%)。HPV30,35和11没有检测到。在ASCUS组中，HPV16的发生率最高(37.3%)，依次为HPV58(29.3%)，HPV31(18.7%)，HPV 39 和HPV 66(16.0%)，HPV 51 (13.3%)，HPV 52(12.0%) ，HPV 56 (10.7%)， HPV18和HPV6(8.0%)，HPV59(5.3%)，HPV33、35和45(2.6%)。ASCUS患者中，HPV58患者的发生率升到29.3%，是正常组的2倍。这种趋势在LSILs和HSILs患者中更明显，它们的发生率分别为28.1%和38.3%。LSILs患者中HPV56是第二被常检测的型别(23.8%)，然后依次为HPV52(17.3%)，HPV16(16.8)，HPV 51(10.8%),HPV 31(9.7%),HPV18(8.6%),HPV39(6.5%),HPV59 和HPV66(5.4%),HPV30(2.2%),和HPV6和HPV35(1.1%)。没有检测到HPV33，45和11。在HSILs患者中，HPV58是最常检测到的型别(38.3%)，再依次为HPV16(35.0%)，HPV52(23.3%)，HPV51 (16.7%)，HPV31(11.7%)，HPV18(8.3%)，HPV33(5.0%)，HPV30(3.3%)和HPV56、39、 6和HPV35(1.7%)，没有检测到HPV66、59、45和11。在HSILs患者中，HPV58的发生率略高于HPV16，其细胞病理异常也最为显著，这可能意味着HPV58是主要高危型之一。LSILs的女性HPV56是发生频率位列第二的病毒(24.2%)。但是，在HSILs的患者，HPV56的频率突然下降到1.7%，可能是HPV56是低危型的过路病毒。