扶正培本系列方药在胃癌综合治疗中的临床与机理研究

         作者：孙桂芝 余桂清 张培彤 吴志奎 李杰 卢文屏

【摘要】  目的］探索扶正培本系列方药在胃癌综合中的临床疗效。［方法］针对胃癌患者不同阶段临床特点和治疗的主要环节，在扶正培本治则指导下的系列治法与方药的临床作用的研究，有针对化疗毒付反应的健脾益肾冲剂、预防转移复发的扶正防癌口服液和针对晚期带瘤患者提高生活质量的养胃抗瘤冲剂。［结果］扶正培本系列方药对化疗药物具有明显的增效减毒作用，提高机体免疫功能，清除有害自由基，提高SOD活性，降低术后复发与转移，提高带瘤患者的生活质量延长生存期等作用。［结论］扶正培本系列方药防治复发转移作用的可能分子机制在于：可以促进肿瘤细胞凋亡信号转导基因Fas蛋白和mRNA表达，降低FasL蛋白和mRNA表达；进而提高起始型Caspase?8的活性；同时提高凋亡调控基因Bax蛋白和mRNA表达，降低Bcl?2/Bax比例，从而减弱Bcl?2蛋白和mRNA表达抑制细胞凋亡的作用，降低肿瘤细胞线粒体膜电位△ψm和降低细胞内PH值，使细胞酸化，通过线粒体途径有效地放大了凋亡信号；最终活化Caspase?3导致细胞凋亡。

【关键词】  胃癌；抗癌机理；扶正培本

目前，胃癌的主要治疗方法是手术与化疗，但术后2～3年极易复发与转移，而且一些患者就诊时已经失去手术机会，化疗的毒副作用常常使患者难以接受和由于严重的血象下降和消化道反应使患者中断化疗。为此，我们自20世纪70年代初，针对胃癌患者不同阶段临床特点和治疗的主要环节，开展了扶正培本治则指导下的系列治法，研制出系列方药：针对化疗毒付反应的健脾益肾冲剂［1?2］、预防转移复发的扶正防癌口服液和针对晚期带瘤患者提高生活质量的养胃抗瘤冲剂。现就扶正培本法系列方药的临床与机理研究结果（方法略）报告如下。1  临床研究 　　健脾益肾冲剂共观察中晚期胃癌（术后）669例，治疗组为414例（治疗组）、对照组255例；扶正防癌口服液观察277例胃肠癌术后患者，治疗组为207例，对照组70例；养胃抗瘤冲剂共观察123例，治疗组77例，对照组46例。均经病确诊随机分为治疗组（化疗+中药），对照组（单纯化疗）。治疗结果如下：

　　1.1  近期疗效

　　1．1．1  扶正培本系列制剂对化疗药物的减毒增效作用观察  （1）治疗组与对照组完成化疗疗程比较，从表1可看出健脾益肾冲剂合并化疗组（治疗组），扶正防癌合并化疗组，养胃抗瘤合并化疗组其化疗完成率与对照组比较有显著差异P<0.05。（2）化疗中全身反应情况比较，见表2；（3）消化道反应情况，治疗组和对照组均有不同程度的食欲下降，恶性，呕吐，腹泻。对照组反应较治疗组明显且重，与对照组比较差异显著，P<0.05，见表3。（4）外周血象变化比较，经化疗后，白细胞＞4000个/mm2为正常，＜4000个/mm2为下降，血小板低于8万/mm2为下降。可看出治疗组白细胞、血小板在治疗后两组差异非常显著P<0.05～0.001。提示健脾益肾和扶正防癌养胃抗瘤冲剂具有良好的保护骨髓、减轻化疗对骨髓的抑制的作用，见表4。

　　表1  治疗组与对照组完成化疗疗程比较（略）

　　**为完成化疗率比较

　　表2  化疗中全身反应情况比较（略）

　　表3  化疗中消化道反应情况比较（略）

　　与治疗组比较，*P<0.05

　　表4  外周血象变化比较（略）

　　与治疗组比较，*P<0.05;**P<0.001

　　1.1.2  养胃抗瘤冲剂对进展期胃癌带瘤患者生存质量的影响采用EORTC QLQ－C30核心量表测评养胃抗瘤冲剂对46例进展期胃癌术后患者治疗前后QOL的影响。按治疗前后各领域标准化得分，进展期胃癌患者经历化疗后，应用养胃抗瘤冲剂治疗3～6个月，不但可以明显提高总体健康和生存质量，而且在生存质量量表的多个领域均有显著改善，突出表现在物理症状、角色功能、情绪功能、社会功能和身体功能方面。以上几个领域通过主成分分析正是此量表中第一主成分，从而更加说明该治法在改善生存质量方面的积极贡献，如图1。

　　1．1.3  扶正培本法对免疫功能的影响

　　表5  晚期胃癌化疗中合并健脾益肾冲剂E?玫瑰花结形成率比较（略）

　　与对照组比较，**P<0.05

　　图1  养胃抗抗瘤冲剂对进展期胃癌术后患者生存质量的影响（略）

　　表6  晚期胃癌(术后)化疗中合并健脾益肾冲剂巨噬细胞吞噬功能治疗后比较（略）

　　与化疗前比较，*P<0.05
   
　　表7  对淋巴细胞转化率的影响（略）

　　与化疗前比较，*P<0.05；**P<0.001

　　表8  对杀伤细胞（NK细胞）活性的影响（略）

　　与化疗前比较，*P<0.05

　　表9  养胃抗瘤冲剂合并化疗与对照组治疗前、后T细胞亚群变化的比较（略）

　　与对照组比较，*P<0.05，***P<0.005   

　　从表5、6、7、8、9可看出治疗前后两组所进行的E?玫瑰花结形成、淋巴细胞转化、巨噬细胞吞噬功能NK细胞活性检查结果可看出：治疗组各项指标均有不同程度的提高，对照组不仅无明显提高反而有的指标显著下降，下降最明显的是淋巴细胞转化，T细胞亚群的检查结果显示治疗组CD8明显下降，CD4/CD8比值显著上升。健脾益肾冲剂、养胃抗瘤冲剂合并化疗与对照组比较，两组比较差异显著（P<0.05～0.01）。

　　1．1.4  扶正防癌口服对患者血清内SOD和自由基水平的影响  见表10～12。

　　表10  胃肠道癌患者与正常人SOD活力比较（略）

　　与正常人比较，*P<0.05
　　
　　表11  治疗组患者治疗后SOD活力及与guZn正常人比较（略）

　　与正常人比较，*P<0.05；与治疗前比较，**P<0.005

　　表12  对照组患者治疗前后SOD活力及与正常人比较（略）

　　与正常人比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005

　　1.5  正常人与胃肠道癌患者血清抗坏血酸自由基峰高比较  见表13。

　　表13  正常人与胃肠道癌患者血清抗坏血酸自由基峰高比较（略）

　　与正常人比较，**P<0.001

　　1.6  两组胃肠道癌患者治疗前后血清抗坏血酸自由基水平及与正常人的比较  见表14。

　　表14  治疗前后血清抗坏血酸自由基水平及与正常人的比较（略）

　　与正常人比较，**P<0.01;***P<0.005;与治疗前比较;△△△P<0.0051.7  超氧化物歧化酶(SOD)活性的变化  见表15。

　　表15  超氧化物歧化酶(SOD)活性的变化（略）

　　从表15治疗组疗后超氧化物歧化酶活性明显提高，疗前疗后差异非常显着，对照组呈下降表现。组间比较差异显着P<0.01。

　　2  远期疗效

　　2.1  健脾益肾方配合化疗远期疗效观察  重点随访Ⅲ期胃癌（术后）1年以上患者，共观察303例，存活300例，一年生存率为99.01%，治疗三年以上者238例，存活184例，三年存活率为77.31%，治疗五年以上者191例，存活102例，五年生存率53.40%，治疗十年以上者76例，存活76例，十年存活率为47.37%。在随访的56例患者的中位生存期为36个月，平均生存期为38.32个月。

　　2.2  扶正防癌口服液合并化疗远期疗效观察：  随访结果：胃癌五年生存率为52.5%（21/40），其中Ⅲ期胃癌五年生存率为62.5%，与健脾益肾冲剂比较五年生存率提高了9.10%，大肠癌五年生存率为72.73%（16/22）其中Ⅲ期五年生存率为76.92%（10/13）。

　　2.3  养胃抗瘤冲剂合并化疗远期疗效  随访结果：对两组各16例患者进行了1、2、3年的随访，治疗组分别为87.5%、37.5%、6.3%，生存期410天;对照组分别为56.3%、6.3%、0%，对照组中位生存期306天，生存率比较,组间差异非常显着，P<0.01。

　　3  机理研究
   
　　通过临床研究可看出健脾益肾冲剂、扶正防癌口服液、养胃抗瘤冲剂均具有保护骨髓、提高机体免疫功能、抑瘤和抗转移的作用。为此我们对其作用机理进行了如下的探讨。

　　3.1  养胃抗瘤冲剂不同剂量合并化疗对荷瘤骨髓有核细胞GM?CSF Mrna表达的影响。

　　表16  不同剂量合并化疗对荷瘤骨髓有核细胞GM?CSF Mrna表达（略）

　　*每一样品均为三只鼠左侧股骨骨髓混合样
   
　　从表中显示单纯CTX组，骨髓中GM?CSF mRNA表达有代偿增加，其水平高于正常对照组和荷瘤对照组；养胃抗瘤冲剂中大小剂量加CTX后骨髓造血刺激因子GM?CSF mRNA表达水平有明显提高，并有一定的量效关系。结果显示养胃抗瘤冲剂合并化疗能明显提高小鼠造血因子GM?CSF mRNA表达水平，这一结果与养胃抗瘤冲剂能显着提高骨髓有核细胞数的结果是一致的。

　　3.2  养胃抗瘤冲剂对前胃（FC）615小鼠骨髓癌细胞原癌基因——myc mRNA表达水平的影响  见表17。

　　表17  对前胃（FC）615小鼠骨髓癌细胞原癌基因myc mRNA表达影响（略）

　　3.3  养胃抗瘤冲剂（中药组）对PC小鼠骨髓、癌组织B1?2/mRNA表达水平的影响  见表18。

　　表18  对PC小鼠骨髓癌组织B1?2/mRNA表达水平的影响（略）

　　（1）每3只小鼠右侧骨髓混合样，共9只小鼠；（2）癌组织为3只小鼠单个样品的均值

　　3.4  养胃抗瘤冲剂对S180实体瘤细胞增殖周期的影响  见表19。从表19可看出：正常对照组骨髓细胞中Bc1?2基因与β?actin基因转录水平相比百分比为47.7%，荷瘤小鼠组为15.9%明显下降，而CTX组则急剧下降至3.5%。

　　表19  养胃抗瘤冲剂合并化疗对S180细胞增殖周期的影响（略）

　　表中显示：G0–G1期细胞数所占有百分数依次为：荷瘤对照组（38.73%）<养胃抗瘤冲剂组（45.82%）<养胃抗瘤冲剂+CTX（52.01%）。而S期细胞数所占百分数依次为：荷瘤对照组（53.16%）>养胃抗瘤冲剂（42.57%）>CTX组（36.59%）>养胃抗瘤冲剂+CTX（31.04%）。荷瘤对照组细胞DNA增殖速度快，主要表现在S期细胞明显增高，化疗药物可明显减少S期细胞百分率。养胃抗瘤冲剂+CTX可明显减少S期细胞百分数，使G期细胞增多，阻滞了G1期向S期过渡（即阻滞了DNA合成前期向S期过渡），因而使S期细胞明显减少，所以这一结果提示：养胃抗瘤冲剂合并化疗对癌细胞增殖周期的影响，主要表现为使细胞阻滞在G1期，减少S期细胞数，使瘤体缩小，且优于单纯CTX组。

　　3.5  养胃抗瘤冲剂诱导MGC?803、BGC?823细胞凋亡细胞学观察  养胃抗瘤冲剂的含药血清具有诱导人胃癌细胞系MGC?803细胞凋亡的作用。荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观察早期染色质聚集于核周边部而呈新月形，晚期细胞核浓缩，并碎裂成大小不等的片段，形成由质膜包绕的含有多少不等核碎片的凋亡小体。细胞核染色质可形成明亮的凝聚块，流式细胞仪检测养胃抗瘤冲剂作用12小时G0?G1期前面出现了明显的亚二倍体峰，随时间延长，诱导细胞凋亡作用更为明显，细胞周期主要表现为细胞阻滞在S期。

　　（A：DNA绿色荧光，B：RNA红色荧光，C：DNA、RNA荧光叠加图象）

　　图2  激光共聚焦显微镜下养胃抗瘤冲剂组诱导人胃癌细胞MGC?803细胞凋亡时形态学变化（略）

　　图3  Annexin V/PI染色，流式细胞仪测定养胃抗瘤冲剂诱导人胃癌细胞MGC?803细胞凋亡（略）

　　3.6  养胃抗瘤冲剂对MGC?803细胞凋亡时细胞内pH、Ca2+、线粒体膜电位（△ψm）影响
   
　　养胃抗瘤冲剂含药血清组与空白血清组比较可以逐渐降低线粒体膜电位，2小时为241.99～251.35，24小时下降为103.13～159.98。养胃抗瘤冲剂组随着培养时间的延长，标记细胞内Ca2+浓度的Fluo?3的荧光强度逐渐增强，从21.50增加到44.43。
   
　　与空白血清组、对照组比较，养胃抗瘤冲剂组随着给药时间的延长，细胞内pH逐渐下降，即细胞酸化。

　　3.7  养胃抗瘤冲剂含药血清对MGC?803细胞凋亡时凋亡信号转导基因Fas/FasL、凋亡调控相关基因Bax、Bcl?2蛋白及基因表达的影响  养胃抗瘤冲剂含药血清可以提高人胃癌细胞MGC?803凋亡信号转导基因Fas蛋白表达，同时养胃抗瘤冲剂还可以降低FasL蛋白、FasL mRNA的表达。
   
　　养胃抗瘤冲剂含药血清可以提高人胃癌细胞MGC?803 Bax蛋白表达，对Bcl?2蛋白表达影响不显著。RT?PCR研究养胃抗瘤冲剂具有促进人胃癌细胞MGC?803 Bax mRNA表达作用，对Bcl?2 mRNA表达无明显影响。

　　3.8  养胃抗瘤冲剂对人胃癌细胞系侵袭转移相关的粘附蛋白表达影响  养胃抗瘤冲剂含药血清可以降低部分具有促进肿瘤转移的黏附蛋白如TSP的表达，对抑制肿瘤转移的黏附蛋白如CD9表达则有促进作用。化疗药可以降低部分促进转移的黏附蛋白如CD44的表达的同时，也可促进部分蛋白如TSP表达，同时又可降低抑制肿瘤转移的黏附蛋白如CD9表达。

　　3.9  养胃抗瘤冲剂对小鼠前胃癌(MFC)术后复发转移T淋巴细胞增殖和凋亡相关蛋白的影响  研究结果显示：中药复方养胃抗瘤冲剂可以提高T淋巴细胞的增殖能力，降低T细胞的凋亡能力，表现在可以降低T细胞的Fas表达，提高FasL表达，见表21。

　　表20  各组615小鼠前胃癌术后15天脾T淋巴细胞增殖能力（略）

　　与正常组比较，﹡P＜0.01；与模型组比较，★P＜0.01

　　表21  615小鼠前胃癌术后15天外周血中T淋巴细胞Fas、FasL表达（略）

　　与正常组比较，﹡P＜0.01；与模型组比较，△P值＜0.05

　　3.10  养胃抗瘤冲剂对小鼠前胃癌(MFC)术后复发转移Fas/FasL、Bcl?2/Bax蛋白表达的影响应用免疫组化法检测。见图的研究结果提示，养胃抗瘤冲剂能增强凋亡信号转导基因Fas蛋白表达，增强促细胞凋亡调控基因Bax蛋白表达，增强Bax/Bcl?2比值，降低FasL蛋白表达从而起到诱导肿瘤细胞凋亡作用。

　　图4  615小鼠前胃癌术后15天肺转移灶和复发灶Fas/FasL、Bax/Bcl?2蛋白表达（略）

　　3.11  实时荧光定量PCR检测肺转移灶Fas/FasL，Bcl?2/Bax mRNA表达  见表22。

　　表22  615小鼠前胃癌术后肺转移灶Fas、FasL mRNA表达（略）

　　与模型组比较，*P＜0.01

　　表23  615小鼠前胃癌术后肺转移灶Bax、Bcl?2 mRNA表达（略）

　　与模型组比较，*P＜0.01

　　3.12  养胃抗瘤冲剂对小鼠前胃癌(MFC)术后复发细胞凋亡信号传导的调控作用  见表23。
   
　　复发瘤细胞caspases?8、3活性采用比色法caspases?8、3 Assay kit（Colorimetric）检测；复发瘤细胞内线粒体膜电位△ψm、Ca2+、pH采肜荧光探针标记，流式细胞仪测定。结果见表24。

　　表23  caspase8、3相对活性检测（A405nm）（略）

　　与模型组比较，*P＜0.01

　　表24  复发瘤细胞内△ψm、Ca2+、pH变化（荧光强度）（略）

　　与模型组比较，*P＜0.01

　　4  讨论
   
　　恶性肿瘤是全身性疾病的局部表现。祖国医学对肿瘤的认识着重整体观念，从人体正邪的消长而论证的。《内经》说：“正气存内，邪不可干”，“邪之所凑，其气必虚”，《医宗必读》中论述肿瘤提出：“积之成也，正气不足而邪气踞之”；《外证医案》更进一步明确提出：“正气虚则成岩。”所以说，癌症的发生、是一个正虚邪实的过程。在病灶局部表现多为邪实的过程。在病灶局部表现多为邪实，而患者整体的表现多是正虚。正气内虚是肿瘤发生和发展的根本原因。在《诸病源候论》中说：“凡脾肾不足，虚弱失调之人，多有积聚之病。”大多数的外界因素，也是在人体正虚的情况下，侵入机体而发病的。
   
　　通过临床与与机理研究表明扶正培本系列方药，不仅具有减轻化疗药物的毒付作用，而且具有抑瘤抗瘤的功效，如养胃抗瘤冲剂的抑瘤率66.3%，ADM为68.3%，其抑瘤作用是通过对癌细胞增殖周期的影响，阻滞了G1细胞向S期过渡，减少S期细胞数，表现为c_myc原癌基因表达水平下降，抑制了肿瘤的发展，使瘤体缩小。其防治复发转移作用的可能机制是通过调控肿瘤发展过程中的关键受体、基因、调控分子等为靶点，促进肿瘤细胞凋亡信号转导基因Fas蛋白和mRNA表达，降低FasL蛋白和mRNA表达；进而提高起始型Caspase?8的活性；同时提高凋亡调控基因Bax蛋白和mRNA表达，降低Bcl?2/Bax比例，从而减弱Bcl?2蛋白和mRNA表达抑制细胞凋亡的作用，降低肿瘤细胞线粒体膜电位△ψm和降低细胞内PH值，使细胞酸化，通过线粒体途径有效地放大了凋亡信号；最终活化Caspase?3导致细胞凋亡。

【】
  1］ 李俊岭，崔成旭，李玉升，等.格拉诺赛特防治胃癌患者EAP方案化疗所致的白细胞减少［J］.肿瘤临床，1999，26（10）：769.

　　［2］ 孙桂芝.健脾益肾冲剂合并化疗治疗晚期胃癌(术后)扶正作用的临床研究［J］.中华肿瘤杂志,1992,7：124.