猕猴骨髓基质细胞的培养及鉴定

【摘要】  　　目的：建立猕猴骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells, BMSCs）的分离、培养及鉴定的方法。方法：体外无菌抽取猕猴骨髓，采用差速贴壁的方法分离、培养猕猴骨髓基质细胞，通过相差显微镜观察其形态特点，并用流式细胞仪鉴定其表面抗原分子。结果：体外分离培养BMSCs以宽大扁平的梭形细胞为主，流式细胞术分析BMSCs免疫表型显示BMSCs CD73、CD105、CD29表达阳性，CD34、CD45、CD11b表达阴性。结论：分离培养的BMSCs具有间充质细胞的特性，可为组织工程化神经提供种子细胞。

【关键词】  骨髓基质细胞 培养 鉴定 猕猴

　　[Abstract]   Objective: To establish the methods of isolation, cultivation and identification of bone marrow stromal cells (BMSCs) of rhesus monkeys. Methods: BMSCs were isolated from other cells by their strong adherence to plastic. The morphologic characters of BMSCs were observed with phase contrast microscope. Flow cytometry was employed to detect BMSCs surface antigens: CD73，CD29，CD105，CD11b，CD34 CD45. Results: Most of these monkey-derived BMSCs were big ancipita spindle cells. BMSCs were immunopositive for CD73、CD105 and CD29, and immunonegative for CD34 、CD45 and CD11b. Conclusion: The cultivated bone marrow stromal cells possess the characteristic of mesenchymal cells and are suitable for the study on the seed cells of tissue engineered peripheral nerve.

　　[Key words]   Bone marrow stromal cells；Cultivation；Identification；Rhesus monkey

　　骨髓基质细胞由于其取材简便，扩增容易，且自体移植克服了伦理和免疫排斥等问题，从而作为种子细胞脱颖而出。近年来的研究表明骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells, BMSCs）具有部分全能干细胞的特点，可定向分化为多种中胚层组织细胞，包括成骨细胞、肌细胞、血管内皮细胞和脂肪细胞等。本实验通过贴壁分离的方法，得到了BMSCs。并且通过流式细胞仪检测相关的骨髓基质细胞表面抗原分子，为猕猴骨髓基质细胞的进一步研究奠定基础。

　　1   材料和方法

　　1.1   试验动物   健康、成年猕猴，由苏州动物实验研究中心提供。雌雄不拘，体重9 kg。

　　1.2 试剂   IMDM培养基及胎牛血清(GIBCO公司)；CD29-FITC抗体、CD105-FITC抗体、CD45-FITC、CD73-PE、CD34-PE均购自BD Biosciences 公司。

　　1.3   方法

　　1.3.1   猕猴骨髓基质细胞的培养   用体外无菌抽取猕猴骨髓，加入IMDM培养基，制成单细胞悬液，将单细胞悬液经过200目筛网过滤，置水平离心机中，以 1000 r/min 离心 5 min，弃上清。用含10%FBS的IMDM培养基(含有青霉素 100 IU/ml，链霉素 100 μg/ml)重悬细胞并计数，调整细胞密度至1×107/ml,接种于100 mm培养皿中，37 ℃ 5%CO2，饱和湿度下培养。24 h后全量换液，换液时轻轻摇晃培养皿，弃培养液，以除去未贴壁细胞。以后每隔3 d换液1次，9~10 d左右细胞铺满皿底（继代3~4 d）时，进行传代，用0.25%胰蛋白酶＋0.02%EDTA的混合消化液消化，37 ℃消化4～5 min,以1×103/cm2的密度传代培养。

　　1.3.2   流式细胞仪检测细胞表面抗原   将P2代的BMSCs，经消化处理后收集细胞悬液于离心管中，预冷0.01 mol/L PBS洗涤2次，1000 r/min×5 min，弃上清，调整细胞密度至1×106/ml, 加入抗体（CD29-FITC、CD105-FITC、CD45-FITC、CD73-PE、CD34-PE）,同时设不加抗体的阴性对照，4 ℃避光孵育30 min，1000 r/min×5 min，弃上清，0.01 mol/L PBS洗涤样品3次，最后用PBS重悬样品，流式细胞仪检测。

　　2   结      果

　　2.1   猴骨髓基质细胞体外培养的形态特点   刚接种的骨髓细胞悬液在倒置显微镜下观察到有大量悬浮细胞。4~6 h后，细胞开始贴壁；至24 h时，贴壁细胞明显增多；24 h后，全量换液，去除以血细胞为主的大量未贴壁细胞；3 d后，贴壁细胞进一步增多，出现部分呈梭形的细胞，并且出现少量扁平与圆形细胞（图1，贴壁细胞上悬浮着少量的血细胞）；5 d后，出现大大小小的集落；9~10 d左右细胞细胞融合到达80%以上，进行传代。细胞传代以后，生长速度明显增快，传代以后，形态趋于均一，以宽大扁平的梭形细胞为主（图2）。

　　2.2  骨髓基质细胞表面抗原鉴定    通过流式细胞仪测定猕猴骨髓基质细胞表面抗原。结果显示：BMSCs CD29(99.87%),CD105(99.16%),CD73(97.99%)表达阳性；而CD34（5.66%）,CD45(5.78 %),CD11b(5.85%)表达阴性（图3）。

　　3   讨      论

　　作为新兴种子细胞—BMSCs，因其取材方便，具有较强的自我更新能力和多向分化潜能而日益受到重视。目前研究表明BMSCs除了能够向成骨细胞，脂肪细胞等中胚层细胞分化以外，还有报道BMSCs可以跨胚层分化成神经细胞、雪旺氏细胞样细胞等[1，2]。同时，也有学者对BMSCs能否跨系分化提出不同观点[3]。目前，对于骨髓基质细胞的研究主要集中于啮齿类动物身上，对于灵长类动物相关的研究还比较少。本实验通过贴壁分离的方法，得到猕猴BMSCs，并且鉴定了细胞表面抗原间充质细胞表面标志呈阳性（CD73、CD105、CD29），造血谱系细胞表面标志呈阴性（CD45、CD34、CD11b）。为进一步研究猕猴BMSCs奠定基础，并为猕猴骨髓基质细胞作为种子细胞与组织工程材料构建“组织工程化神经”修复外周神经缺损研究奠定基础。

【】
  [1] Munoz-Elias G, Woodbury D, Black IB, et al. Marrow stromal cells, mitosis, and neuronal differentiation: stem cells and precursor functions[J]. Stem Cells，2003，21(4):437-444.

[2] Chen X, Wang XD,Cheng G, et al. Study of in vivo differentiation of rat bone marrow stromal cells into schwann cell-like cells[J]. Microsurgery, 2006, 26(2):111-115.

[3] Wurmser AE, Gage FH. Stem cells: Cells fusion causes confusion[J]. Nature,2002，416(6880):485-487.