质粒介导的AmpC β-内酰胺酶的研究进展

【摘要】  　　质粒介导的AmpC β-内酰胺酶是近年来发现的一种新型β-内酰胺酶。革蓝阴性杆菌中质粒介导的AmpC酶引起的耐药，因其耐药范围扩大、耐药性由质粒转移、发生率快速增长及新基因型的不断发现，已成为严重的公共卫生问题，引起临床高度重视。大多数质粒介导的AmpC β-内酰胺酶是非诱导表达，其耐药基因在质粒与染色体间及质粒间转移可能是通过质粒、转座子、整合子等多种途径实现。

【关键词】  AmpC β-内酰胺酶 质粒 耐药性 细菌

　　革蓝阴性杆菌对β-内酰胺类抗生素耐药，已成为当今全球临床抗感染面临的棘手问题。耐药菌株产β-内酰胺酶是革蓝阴性杆菌对β-内酰胺类抗生素耐药的主要机制,而AmpC β-内酰胺酶（简称AmpC酶）是其中的一个重要因素。近年研究发现AmpC酶不仅由染色体介导，也可由质粒介导，且质粒介导者因具其有较快的传播速度和较强的耐药性，日益受到人们的重视。本文阐述了质粒介导AmpC酶(简称pAmpC酶)的生物学特点、命名原则、基因同源性，遗传特征、菌株的耐药谱以及质粒介导AmpC酶的检测方法。

　　1   pAmpC酶的生物学特点

　　AmpC酶是指由革蓝阴性杆菌产生的不被克拉维酸抑制的“丝氨酸”头孢菌素酶，属Bush-J-M1群，按Ambler分子结构分类为C类的头孢菌素酶，其优先选择的底物为头孢菌素类抗生素，与超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）不同的是对头霉烯类抗生素（如头孢西丁）高水平耐药，并不被克拉维酸所抑制。AmpC酶可分为诱导型、结构型和质粒介导型[1]。自1988年首次发现质粒介导的AmpC酶—MIR-1以来，迄今报道的质粒已有30余种[2]。pAmpC酶最常见于一些天然缺乏染色体ampC酶结构基因或调节基因的细菌，如克雷伯菌属、大肠埃希菌、奇异变形菌、沙门菌属以及某些志贺菌属等。染色体ampC基因的典型表达为诱导表达，由amp操纵子控制，即结构基因ampC的表达同时受到4种调节基因ampR、ampD、ampE和ampG的调控。与染色体ampC酶不同，pAmpC酶是非诱导表达的。因为其ampC编码基因上游未发现有调节基因ampR的同源序列，所以绝大多数质粒介导的AmpC酶都是呈持续高水平表达状态[3]。但个别细菌的pAmpC酶有可诱导性[4~7]。

　　2   pAmpC酶的命名原则[8]

　　根据已发现的酶的名称进行归类，其命名规则有：（1）根据酶对某种抗生素命名：CMY酶是根据该酶对头霉素类抗生素(cephamycins)有较强的水解作用得名。FOX酶是根据该酶对头孢西丁(cefoxitin)得名。MOX和LAT的命名也是如此，分别取拉氨头孢moxalactam和latalactam的缩写；（2）根据酶的发现地点命名：MIR是取了分离产该酶肺炎克雷伯菌的Miriam的前3个字母，DHA同样是发现地沙特阿拉伯Dhahran医院的前3个字母；（3）根据酶的类型命名：ACT是AmpC type的缩写，ACC是由Amber ClassC 3个单词的第一个字母组成；（4）根据分离产酶菌株的患者姓名命名。BIL是根据感染产该酶的大肠埃希菌的患者姓名(Bila1)的前3个字母命名。

　　3   pAmpC酶基因的同源性

　　对pAmpC酶基因DNA序列及pAmpC酶氨基酸序列进行分析，并与各种菌株来源的染色体介导的ampC基因及表达产物AmpC酶进行同源性分析比较，可将pAmpC酶分为6群[9]：（1）弗氏柠檬酸杆菌群 包括LAT型、部分CMY型、BIL-1和CFE-1；（2）肠杆菌属群 包括MIR-1型和ACT-1型，两者之间的氨基酸同源性是91.4％；（3）摩根摩氏菌群 包括DHA-1和DHA-2，可诱导型。DHA-2是DHA-1发生点突变而来，与摩根摩氏菌ampC基因的同源性为99％[10]；（4）蜂房哈夫尼亚菌群 ACC-1型最初是1997在德国的Kiel，从肺炎克雷伯菌可转移的质粒上分离到，与其他型AmpC酶耐药表型不同的是对头霉素的低MICs[11]；（5）气单胞菌属群 有FOX型，在克雷伯菌和大肠埃希菌中传播。有6个亚型（FOX-1，2，3，4，5，6)，各亚型间有>96％的同源性，其中FOX-1型是个可1种基因编码2种分子变异体的AmpC型β-内酰胺酶；（6）其他群：有MOX型和部分CMY型。MOX型目前有MOX-1和MOX-2两个亚型，克拉维酸和氯唑西林可完全抑制MOX一1型酶活性，而MOX-2的特点是对各种β-内酰胺类抗生素耐药，对头孢西丁和头孢替坦有异常高水平的水解活性，测序显示与MOX-1的同源性为92.9％[12]。

　　4   pAmpC酶的遗传特征

　　质粒上ampC基因大小在7～180 kb，一些质粒不能自行传递，但可以通过转化和移动传递。质粒介导的AmpC酶具有AmpC酶典型生化特性和抗药性，但其水解底物范围更广，耐药质粒往往同时携带氨基糖甙类、氯霉素、磺胺、甲氧卞氨嘧啶、四环素等抗生素耐药基因，常具有多重耐药的特点。一些编码AmpC酶的质粒同时还携带有编码其它β-内酰胺酶基因。bla基因可以位于不同的质粒上，但多数情况下共存于同一质粒上，如编码ACC-1质粒同时编码TEM-10或TEM-26或SHV-1等ESBLs，含这种质粒的菌株被称为产超超广谱酶(SSBL)菌株。染色体ampC基因不仅可以从染色体上转移到质粒，而且可以在不同菌种之间转移。Bret在普通变形杆菌CF09中发现来源于弗劳地枸橼酸杆菌上的ampC基因，研究表明这段基因位于普通变形杆菌染色体上，通过DNA序列及氨基酸序列分析发现它与来源弗劳地枸橼酸杆菌染色体ampC基因仅有三个碱基不同，即在167位由blacmy 2A-T，在703位由T-C，在1130位由G-A，对应氨基酸BLA酶22位由Glu-Gly，201位由Trp-Arg，340位由Ser-Asn。推测弗劳地枸橼酸杆菌染色体ampC基因可能通过转座子作为载体转移到质粒上，这种质粒转移到普通变形杆菌CF09中，接着质粒上ampC基因又被整合到普通变形杆菌CF09染色体上。

　　5   产pAmpC酶菌株的耐药谱

　　pAmpC酶具有典型的头孢菌素酶的特征，对青霉素类抗生素除替莫西林和amdinocillin外其余均耐药，对第3代头孢菌素耐药，对头孢他啶的最小抑菌浓度（MIC）通常高于头孢噻肟。与ESBLs不同，pAmpC酶对头霉素类抗生素有较强的水解作用，产pAmpC酶菌株头孢西丁MIC大多数在128 μg/ml以上。FOX-4对头孢西丁的MIC高达512 μg/ml，但是ACC-1和CMY-4对头孢西丁水解作用弱，其相应菌株的MIC分别为4  μg/ml和8 μg/ml。对拉氧头孢除MIR-1，MOX-1和MOX-2外,对其水解能力均较低，产MOX-1菌株对拉氧头孢的MIC高达512 μg/ml。大部分pAmpC酶对单环类抗生素氨曲南有较高的水解能力，产pAmpC酶菌株氨曲南的MIC明显低于第3代头孢菌素和头霉素类抗生素的MIC。对第4代头孢菌素头孢匹罗，头孢吡肟和碳青霉烯类抗生素亚胺培南和美洛培南水解能力低。但是当耐药菌株缺少外膜孔蛋白时，外膜渗透性降低，抗生素难以进入细菌内，菌体内又产生pAmpC酶，亚胺培南和美洛培南的MIC大幅上升甚至耐药。若加大接种菌量对头孢匹罗和头孢吡肟的MIC也大幅上升。

　　质粒介导AmpC酶不被现有的酶抑制剂抑制，克拉维酸几乎无抑制作用，舒巴坦稍强，可被氯唑西林抑制，正在研究开发的酶抑制剂BRIA2715、RO47-8284、RO48-1256、RO48-1220对pAmpC酶有较强的抑制作用。     

　　6   pAmpc酶的检测方法

　　NCCLs没有推荐检测ampC酶的标准方法，国内外研究者都做了大量的探索。目前可用于pAmpC检测的方法有以下几种。

　　6．1   表型筛选法   （1）微量稀释法(MIC法)：手工的(微量)肉汤稀释方法参照NCCLS的方法进行；也可用MicroSean等微生物分析仪进行分析，操作方法按其操作规程进行。判断标准为MIC>16 μg/ml表示待检菌株对FOX耐药。对FOX耐药的菌株，应怀疑产AmpC酶可能；（2）纸片扩散法：按美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)的纸片扩散(K—B)法进行。FOX纸片的含量为30 μg。判断标准为抑菌环<18 mm，表示待检菌株对FOX耐药。

　　6．2   AmpC酶抑制剂筛选法   （1）双纸片氯唑西林增效试验[13]氯唑西林抑制AmpC酶的活性，对大多数ESBLs没有影响，因此可以和超广谱头孢菌素进行纸片协同试验；（2）AmpC酶抑制剂纸片法 Black等用A类酶和C类酶阻滞剂（LN-2-128、48-1220）研究检测批批pAmpC酶菌株的法：在5种标准β-内酰胺类抗生素药敏纸片上各加20 μg的48-1220或LN-2-128，加了抑制剂纸片的抑菌环>不加抑制剂相应药敏纸片4ram为阳性。其中头孢替坦及加20 μg LN-48-1220或LN-2-128的纸片组合最适用于AmpC的筛选(特异性为90%和96%、敏感性为100%和965)，但这些抑制剂不易获得[14]。

　　6．3   三维试验[15]   （1）提取粗酶（冻融法） 经典法：将在血平板生长（35 ℃）过夜菌稀释成0．5麦氏单位，取150 μ1接种于50 ml胰蛋白大豆肉汤中，35 ℃震荡培养4 h，收集菌液于离心管中，4 ℃ 4 000 r/min离心20 min，弃上清液，-70 ℃反复冻融5次，加2．5 ml pH7．0的0．01 mol/L PBS后混匀，4 ℃12 000 r/min离心20 min，取上清粗酶液-70℃保存备用；（2）三维试验经典法：用冻融法破碎待检菌细胞，制备酶粗提液。将大肠埃希菌ATCC25922稀释成0．5麦氏单位，涂布于90 mm 的M-H平板上，平板中心贴头孢西丁纸片，距离纸片边缘5 mm处，用无菌刀片向外切宽长为1mm×15 mm 的狭缝，弃去挖出的琼脂，将提取的粗酶液30 μ1加入切好的狭缝中，35 ℃过夜观察结果；（3）头孢西丁三相试验：头孢西丁三相试验与酶提取物三维试验的区别是将待测菌直接接种到槽中，简化了提取酶的繁琐过程。这种方法操作简单，但易受到待测菌其它耐药机制的影响，假阳性率较高[16]。

　　6．4   分子生物学检测方法   主要通过PCR的方法，使用特异性引物，检测细菌是否携带ampC基因。对染色体非固有ampC基因的菌株，如扩增出ampC基因就可疑为是质粒介导的。染色体上固有ampC基因的革蓝阴性杆菌高产AmpC酶多因相关调控基因的突变造成(主要是ampD基因的突变)，可通过扩增ampD基因及测序来判断。如在这些菌株中扩增出其它菌属染色体ampC基因的核苷酸片段，可通过质粒接合和转化试验检测耐药性的转移或通过ampC特异性探针杂交技术确定ampC基因是位于染色体或是质粒上。Pierez等根据ampC基因的同源性，设计了6组引物。扩增范围几乎涵盖了所有的质粒ampC基因序列。以细菌DNA作为模板，用多重PCR技术检测质粒ampC基因。通过测序和序列比对确定基因型和发现新基因型。

　　近10余年来，由于质粒水平传播的特点，pAmpC酶的发生率和在菌种中的分布在不断增长。新的基因型也不断发现，甚至已造成多次内的暴发流行。pAmpC酶是一组来源于不同细菌染色体的异质酶，对耐药表型筛选法和抑制剂筛选法具有不同的表型，并非所有的基因型都可被测出，在检测范围上有一定的局限性。三维试验和分子生物学检测方法不易在临床实验室开展。因此，应进一步研发简便、快速、准确的检测技术提高此类酶的检出，加强对相应菌感染的研究，控制质粒介导AmpC酶的蔓延。

【】
  [1] 刘 晶.染色体介导的AmpC酶研究进展[J]. 国际检验医学杂志， 2006,27(7):641-643.

[2] Philippon A,ABet G,Jaeoby GA．Plasmid-determined AmpC-lype Bela-laelamases[J]． Anlimierob Agenls Chemolher．2002，46（1）：1-l1.

[3] 陆玮新，章自强．质粒介导的AmpC酶分子生物学研究进展[J]． 中华内杂志，2006,3(3) :281-283.

[4] Fonineau N，Poirel L，Nordmann P．PIasmid-mediated and inducible cephalo8p0rina8e DHA -2 from Klebsiella pneumoniae[J]． Antimicrob Chemother，2001，47(2)：207-210．

[5] Fotfineau N，Naas T,Nordmann P, 等．SHV-type extended-spectrnm beta-laetamase in a Shigella flexneri clinical isolate[J]． Antimicrob Chemother，2001，47(5)：685-688．

[6] Literaeka E，Empel J．Four variants of the Citrobactar freundii AmpC-type eephalosporinases．including novel enzymes CMY-l4 and CMY-l5．in a Proteus mirabilis clone widespread in Pol and[J]． Antimicrob Agents Chemother 2004，48(11)：4136-4143．

[7] Nakano R, Okamoto R, Nakano Y, et al. CFE-1，a novel plasmid-encoded AmpC beta-lactamases with an ampR gene originating from Citrobacter freundii[J]． Antimicrob Agents Chemother，2004，48(4)：1151-1158．

[8] 余方友． 质粒介导的AmpC酶研究进展[J]. 中华医学检验杂志， 2003,26(11):706-709.

[9] Philippon A，Arlet G，Jacoby GA,et a1．Plasmld-Determined Am．pC．Type-Lactamases[J]． Antimlcrob Agents Chemother，2002.46(1)：1-11．

[10] Fortlneau N，Poirel L,Nordmann P．Plasmid-mediated and in-ducible cephalosporinase DHA-2 from Klebsiella pneumoniae[J]． Antimicrob Chemother，2001，47(2)：207-210．

[11] Bauernfeind A，Schneider I，Jungwirth R，et a1．A novel type of AmpC beta-lactamase，ACC-1，produced by a Klebsiella pneumoni-ae strain causing nosoeomlal pneumonia[J]． Anfimicrob Agents Chemother，1999，43(8)：1924-1931．

[12] Raskine L，Borrel I，Barnaud G，et a1．Novel plasmid．Encoded class C beta-lactamase(MOX-2)in Klebsiella pneumoniae from Greece[J]． Antimicrob Agents Chemother，2002，46(7)：2262-2265．

[13] 余丹阳，刘又宁，崔 岩，等．双纸片氯唑西林增效试验检测高产AmpC酶的阴沟肠杆菌[J]． 抗生素杂志，2004，29(4)：238- 243．

[14] Black JK，Thomson KS．Pitout JDD．Use of beta-lactamase in-hibitors in disk tests to detect plasmid-mediated AmpC beta-lactamase[J]．J Clin Microbiol，2004，42(5)：2203-2206．

[15] 侯晓娜，傅炜昕，杨 婧，等．检测AmpC酶三维试验方法的改进[J]. 中华医院感染学杂志,2005,15(9):1077-1080.

[16] 周铁丽，林晓梅，李 超，等．评价三种检测AmpC酶的方法及临床应用[J]． 中华检验医学志，2003,26(7)：445-446．