二氯化钴诱导大鼠肝癌细胞缺氧与凋亡和增殖的研究
【摘要】 目的：了解大鼠肝癌细胞系CBRH7919在缺氧状态下凋亡和增殖的关系，探讨低氧诱导因子（hypoxia induced factor, HIF-1α）在此诱导过程中的作用。方法：二氯化钴（CoCl2）作为缺氧诱导剂。利用RT-PCR和免疫细胞化学法检测CBRH7919细胞HIF-1α在转录水平和翻译水平的表达，利用流式细胞仪检测CBRH7919细胞在不同缺氧程度下细胞凋亡率、细胞周期和线粒体膜电位的变化。结果：（1）随缺氧程度的加重，HIF-1α在转录和翻译水平的表达逐渐增加；（2）流式细胞仪结果显示经300 μM CoCl2分别处理0、4、24小时后细胞凋亡率分别为（2.31±1.1）%、（5.62±2.4）%、（21.2±7.5）%。对照组和4小时处理组细胞周期改变不显著，24小时处理组出现显著G0/G1期阻滞。处理组细胞线粒体膜电位较对照组有不同程度的降低。结论：大鼠肝癌细胞随着缺氧程度的加重，细胞凋亡明显增加，伴随细胞周期进入G0/G1阻滞及线粒体膜电位降低；HIF-1α的表达增加在此过程中发挥重要作用。
【关键词】 肝癌细胞 缺氧 凋亡 低氧诱导因子
[Abstract] Objective: To investigate the apoptosis and proliferation of hepatocellular carcinoma cells induced by hypoxia, and to study the role of HIF-1α in the induction course. Methods: CBRH7919 cells were treated with 300 μM CoCl2 for 0, 4 and 24 hours. The expressions of HIF-1α at the levels of transcription and translation were detected by RT-PCR and immunocytochemistry. The change of cell cycle, membrane potential of mitochondria and apoptotic ratio were detected by flow cytometry. Results: HIF-1α was upregulated both at the transcriptional and translational levels under hypoxic condition. Apoptotic ratios of CBRH7919 cells were (2.31±1.1)%, (5.62±2.4)% and (21.2±7.5)% respectively. CBRH7919 cells appeared notable cell arrest at G0/G1 phase under severely hypoxia. There was also a decrease in the mitochondria membrane potential. Conclusion: Cobalt dichloride can induce apoptosis of rat hepatocellular cell line CBRH7919, and HIF-1α plays an important role in this hypoxia-induced apoptosis.
[Key words] Hepatocellular carcinoma cell; Hypoxia; Apoptosis, Hypoxia inducible factor
氧稳态的维持是细胞生命活动的基本前提。低氧诱导因子（hypoxia inducible factor，HIF）在缺氧的情况下被激活，是最重要的低氧信号转录调节因子[1，2]。本实验从缺氧诱导大鼠肝癌细胞凋亡和增殖的角度，初步探讨HIF-1α在缺氧环境下的表达及其与细胞凋亡和增殖的关系。
1 材料和方法
1.1 材料 大鼠肝癌细胞系CBRH7919购自中科院上海细胞生物学研究所, 二氯化钴（CoCl2）购自汕头化学试剂公司（分子量237.93），SP免疫组化试剂盒购自北京中山试剂公司，单克隆抗体HIF-1α购自Neomarkers，Trizol Rna购自Invitrogen， RT-PCR 试剂盒购自TaKaRa，Annexin V-FITC 试剂盒购自Beckman Coulter。余试剂及仪器均由天津市肿瘤研究所中心实验室提供。
1.2 方法 免疫组化步骤SP试剂盒说明，采用DAB显色，高倍光镜观察，阳性细胞的胞核可见棕黄色染色，部分胞浆也可染色。细胞总RNA的提取按照TRIzol RNA提取试剂盒说明，分光光度法检测提取RNA的纯度和浓度。引物的设计：
HIF-1α（扩增长度168 bp）
上游：5'-GGACAAGTCACCACAGGA-3'；
下游：5'-GGAGAAAATCAAGTCGTG-3'。
β-actin（扩增长度114 bp）
上游：5'-ACCCCCACTGAAAAAGATGA-3'；
下游：5'-ATCTTCAAACCTCCATGATG-3'。取PCR反应产物5 μl，进行1%琼脂糖凝胶电泳，在kodak440凝胶成像系统照相并测定各条带吸光度A值。细胞凋亡率和细胞周期的检测参考Annexin V-FITC Kit试剂盒说明。将含有终浓度为10 μg/ml 罗丹明123的无FBS培养基重悬细胞沉淀，在488 nm波长的激发光下检测细胞荧光强度。
1.3 统计学方法 实验数据采用SPSS13.0统计软件分析，采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 免疫组化结果 显示对照组和4 h处理组HIF-1α不表达或低表达，24 h处理组在胞核及胞浆表达呈阳性或强阳性（图1）。RT-PCR结果显示对照组和4 h处理组HIF-1α mRNA不表达或极低表达，而24 h处理组可清晰见到168 bp和114 bp的2条清晰条带（图2）。
2.2 流式细胞仪结果 显示经300 μM CoCl2分别处理0、4、24 h后细胞凋亡率分别为（2.31±1.1）%、（5.62±2.4）%、（21.2±7.5）%，24 h处理组与对照组和4小时处理组差异均有统计学意义（P<0.05）。细胞周期G0/G1%分别为（45.0±5.7）%、（47.4±9.3）%、（66.4±13.5）%，4 h处理组与对照组差异无统计学意义（P＞0.05），24 h处理组与对照组有显著差异（P<0.05）。处理组细胞线粒体膜电位较对照组降低，降低的程度随缺氧的加重而增加。
3 讨 论
原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，经皮肝动脉栓塞化疗是肝癌非手术的首选方法。肝癌的血供主要来自于肝动脉，阻断肝动脉可使肝癌血供减少90%以上，各种栓塞剂可使肝癌细胞和肿瘤血管内皮细胞发生缺血缺氧、凋亡和坏死。缺氧在此治疗过程中发挥着重要作用。
已有报道认为三氧化二砷对肝癌细胞具有抑制作用[3]，本实验利用CoCl2作为缺氧诱导剂，使大鼠肝癌细胞系CBRH7919产生缺氧状态。在轻微缺氧状态下（CoCl2在300 μM浓度下处理4 h以内），细胞凋亡不明显，HIF-1α的表达也未明显增加，细胞线粒体的膜电位有轻微下降，但并未引起强烈的线粒体通透性转换孔的不可逆开放。随着缺氧程度的加重（CoCl2在300 μM浓度下处理24 h以上），HIF-1α在转录和翻译水平表达增加，利用流式细胞仪可以检测到细胞周期进入G0/G1阻滞状态，而在正常氧气浓度条件下细胞周期各期比例未受明显影响。细胞增殖受抑制，并且凋亡增加，这与HIF-1α表达增加相一致。以上结果说明HIF-1α在缺氧诱导大鼠肝癌细胞凋亡过程中发挥重要的作用，也可以从缺氧的角度解释HIF-1α在介入治疗原发性肝癌中可能发挥的机制。
缺氧可以通过抑制线粒体呼吸链、降低线粒体膜电位，增加活性氧的生成，以及通过JNK/SAPK等信号途径诱导凋亡[4]。低氧合并低糖可以使野生型胚胎干细胞减少增殖和增加凋亡，而对敲除HIF-1α基因的胚胎干细胞无此作用，因此可以解释来源于HIF-1α基因敲除的胚胎干细胞的肿瘤生长速度快于野生型者。
细胞周期G0/G1阻滞是细胞凋亡所必需的，通过增加细胞凋亡，减少细胞数量，使细胞代谢减慢，亚致死损伤不易被修复，对于治疗有益。但另一方面，细胞处于静止的G0/G1期，对细胞周期特异性药物不敏感，同时为DNA损伤的修复提供了时间，可以提高突变型P53肿瘤细胞的比率。所以G0/G1期阻滞对于肿瘤治疗的利弊取决于以上因素的综合作用。
因此，HIF-1α通过诱导肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞凋亡的增加、增殖的抑制，在肝癌治疗中发挥重要的作用。最近，HIF-1α在肿瘤血管生成中的作用受到重视[5]。可以通过调节HIF-1α的稳定性和降解，或调解其活性来发挥抗肿瘤的作用[6,7]。随着研究的深入，相信以HIF-1α为靶点治疗肿瘤将可能成为肿瘤治疗的一个重要手段。
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