实验性脑出血大鼠脑组织形态学的动态变化
作者：王丹，李平友，郑勇，柯岩，段丽欢，王秋桂，殷妮娜，陈业文
【摘要】 目的 研究大鼠脑出血后神经元改变及胶质增生的动态变化特征以及变化对行为学的影响。方法 将SD大鼠随机分为正常对照组、假手术组、出血组（分12h组、24h组、48h组、72h组4个时相组，每组5只）。采用自体股动脉血注入尾状核建立大鼠脑出血模型，通过对脑血肿周围脑组织坏死神经元计数和Longa行为学评分，动态观察各组大鼠脑血肿周围组织形态学的变化及神经功能状态。结果 脑出血组12h即出现血肿周围脑组织部分神经元变性坏死，少数炎性细胞浸润，48h达高峰，72h后可见血肿周围胶质细胞、血管增生。脑出血组各时点的神经功能障碍评分均高于正常对照组和假手术组（P均<0.05）。结论 脑出血后神经元变性、坏死，胶质细胞和血管增生可能是脑水肿加重和病情加重的主要原因之一；神经行为学变化与神经元病变及神经胶质细胞的增生性反应之间存在明显相关。
【关键词】 脑出血；形态学；行为；大鼠
ABSTRACT:Objective To dynamically observe the neuronal changes and gliosis hyperplasia in perihematoma，and the behavioral changes after Intracerebral Hemorrhage(ICH) in rats.Methods The SD rats were divided into control group, sham operation group and ICH group.All the rats of the ICH group were assessed at 12h,24h,48h,72h after ICH.The intracerebral hemorhage model was established by injecting auto?non?anticoagulated artery blood into the caudate nucleus of the rats.Neurobehavioral outcome was assessed in perihematoma.Results Some neurons displayed necrosis and few inflammatory cells were observed in the perihematoma region at 12 hours after ICH,reached to the top at 48 hours.At 72 hours after ICH gliosis and capillary hyperplasia were observed around hematoma. Neurobehavioral scores at various stages in ICH group were higher than those in control and sham group（P<0.05）.Compared with control group,there were nerve cell necrosis and glia cell hyperplasia. Conclusion Neurobehavioral change closely was related to both nerve cell necrosis and hyperplasia reaction of glia cell.
KEY WORDS：Intracerebral hemorrhage;Histomorphology;Behavior;Rat
脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是自发的非外伤性脑实质内出血。其发病率高、死亡率高、致残率高[1]。ICH后脑水肿形成是导致脑损伤的重要环节。急性期血肿扩大和脑水肿是导致ICH病情加重的主要原因，控制继续出血和减轻脑水肿是ICH的关键。但水肿的发生和机制目前仍不清楚。探讨ICH规律及其机制，对临床上治疗和控制病情的加重至关重要。为此，我们应用脑立体定向技术，用大鼠自体动脉血建立脑出血模型，动态观察其行为学及血肿周围脑组织形态学变化。
1 材料和方法
1.1 实验仪器
江湾Ⅱ型立体定向仪；微量注射器；显微外科手术器械；牙科钻；德国leica（RM2245）石蜡切片机；Motic（BA300）数码摄像系统和olympus（CH2）生物显微镜。
1.2 实验动物及分组
健康成年SD雄性大鼠60只，体质量220～250g，由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供（SCXK鄂2004?2007），以标准饲料喂养，饮用纯净水，恒温(20℃～25℃)。随机分为正常对照组（n=20）、假手术组(n=20)、出血组(ICH组,n=20)。其中ICH组分为12h、24h、48h、72h等4个时点，每个时点5只大鼠。
1.3 大鼠尾状核脑出血模型建立
参照Lee的方法[2],大鼠经10％水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射麻醉后，俯卧位固定于立体定位仪上，于前囟前0.5mm中线右旁开3.0mm处用牙科钻钻一直径为1.0mm的小孔,用微量进样器（针管肝素化）经右侧股动脉抽取血液50μl，立即于立体定位仪上沿钻孔进针，进针深度6.0mm(即尾状核位置)，缓慢注入血液，注完后留针10min再缓慢退出针头,用无菌骨蜡封闭钻孔，缝合切口。假手术组只进针而不注血，术后相应时点处死。
1.4 大鼠神经功能评分
按照Longa的5分法进行神经功能行为学评分[3]。0分:无神经缺损症状;1分:左前肢不能完全伸直;2分:向左旋转;3分:向左侧倾倒;4分:不能行走或昏迷。分数越高，神经功能障碍越严重。
1.5 脑组织形态学观察
各组大鼠，常规左心室灌注固定、取材（从注射点前后附近1.0mm切开），常规石蜡包埋，行4μm切片，HE染色后光镜下观察组织学变化。每组随机选5片进行细胞计数。ICH组选取血肿周围区，其它组也选择相应脑区，每片计10mm2单位高倍视野坏死神经元数[4]。
1.6 统计学处理
所测数值均用±s表示，P<0.05为差异有显著性，P<0.01为差异有极显著性。各组之间比较采用方差分析及t检验，变量间相互关系采用直线相关分析。全部统计用SPSS13.0软件完成。
2 结 果
ICH组各时点神经功能障碍评分均高于正常对照组和假手术组（P均<0.05）。ICH组各时点脑组织坏死神经元数均高于正常对照组和假手术组（P均<0.05）。ICH组各时点神经功能障碍评分与相应时点脑组织坏死神经元数呈正相关（r=0.894，P<0.01）。（表1、2）
表1 各组大鼠神经功能障碍评分比较(±s)
组别12h24h48h72h正常对照组0000假手术组0.60±0.150.20±0.0500ICH组2.20±0.64*2.60±0.69*4.20±0.84**3.40±1.04**
与假手术组比较，*P<0.05、**P<0.01表2 各组大鼠坏死神经元计数比较(±s)
组别12h24h48h72h正常对照组0000假手术组4.00±1.582.20±0.301.40±0.251.20±0.25ICH组8.20±0.84*13.20±1.30**14.20±1.92**11.80±2.59**
与假手术组比较，*P<0.05、**P<0.01ICH组血肿周围脑组织的病理变化：脑出血后12～24h血肿周围可见神经元胞体明显肿胀，少量胶质细胞增生，细胞间隙和血管周围间隙增宽（图1、2），48～72h上述病变加重，并见大量神经元核浓缩，胞浆红染加深，胶质细胞增生活跃（图3、4）。
3 讨 论
我们通过对实验性大鼠ICH血肿周围不同时点的形态学观察，发现血肿周围存在不同程度神经元坏死及胶质细胞和血管增生，与报道一致[5]。
ICH可引起多种继发症状如：脑水肿、颅内压增高、脑疝等，其中脑水肿的产生是脑出血后二次损伤发生的关键性因素，是导致神经功能障碍的主要原因。脑水肿主要表现为脑组织中水分的非正常集聚，伴有脑容积的增加，导致颅内高压，直接威胁病人生命。然而，脑出血后脑水肿发生的机理仍不很清楚，其发生机制的研究成为大家关注的焦点。ICH后，来自血液的炎性递质，如凝血酶、补体和纤维蛋白降解产物，可进入脑组织诱导炎性反应。Koeppen[6]等认为主要是血液中的血浆蛋白刺激了小胶质细胞的活化，引起小胶质细胞胞体增大，突起增多，并迅速向血肿周围迁移。Chao等[7]报道，实验性大鼠ICH后1d和3d时血块内及周围有许多MPO阳性中性粒细胞浸润；脑出血后3d时，血块周围激活的小胶质细胞开始增多。
实验性大鼠ICH血肿周围组织形态学改变与出血后时间密切相关，且具有相应的行为学变化。探讨ICH后脑水肿形成、血肿周围不同时间点组织形态学改变的机制，有助于为脑出血寻找新的思路。
【文献】
[1]Davis S,Lees K,Donnan G.Treating the acute stroke patient as an emergency:current practices and future opportunities[J].Int J Clin Pract，2006，60(4):399
[2]Lee KR，Betz AI，Kim S，et al．The role of the coagulation cascade in brain edema forolation aftm intracerebral hemorrhage[J]．Acta Neurochir，1996,138(2)：396
[3]Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al．Reversible middle cerebral artery occlusion without craniotomy in rats[J]．Stroke，1989，20(1)：84
[4]兰希发.大鼠脑缺血再灌注后水孔蛋白?4的免疫组化表达与脑水肿关系的研究[J].中风与神经疾病杂志，2004，10（5）：409
[5]张春燕，李亚明.还元注射液对实验性脑出血大鼠脑组织显微、超微结构的影响[J].临床康复，2004，8（1）：186
[6]Koeppen AH，Dickson AC，Mcevoy JA．The cellular reaction to experimental intracerebral hemorrhage[J]．J Neurol Sci，1995,134：102
[7]Chao G，Julian TH，Richard FK．Acute inflammatory reaction following experimental intracerebral hemorrhage in rat[J]．Brain Res，2000，871：57
