晚期糖基化终产物对高糖诱导NRK?52E细胞的转分化作用

【摘要】  目的： 探讨晚期糖基化终产物（AGEs）对高糖诱导大鼠肾小管导管上皮细胞株NRK?52E的转分化干预作用。方法： 大鼠肾小管导管上皮细胞株设空白组（不给葡萄糖）、高糖组（25 mmol/L葡萄糖）、AGEs干预组（100 mg/L AGEs）、高糖AGEs干预组（100 mg/L AGEs+25 mmol/L葡萄糖），培养72 h后，用Western bolt检测转化因子β1（TGF?β1）、Ⅰ型胶原、金属蛋白酶2（MMP2）、α平滑肌肌动蛋白（α?SMA）及甲状旁腺素相关肽（PTHrP）在NRK?52E细胞的表达，活性氧（ROS）含量应用CM2H2DCFDA试剂盒检测。结果： 高浓度葡萄糖上调TGF?β1、Ⅰ型胶原、MMP2、α?SMA以及PTHrP表达，AGEs显著上调高浓度葡萄糖状态下TGF?β1、Ⅰ型胶原、MMP2、α?SMA和PTHrP表达，提高ROS含量。结论： AGEs可以促进高浓度葡萄糖诱导肾小管导管上皮细胞转分化。

【关键词】  糖基化终产物，高级； NRK?52E 细胞； 葡萄糖； 受体-转化生长因子β； 胶原I型； 基质金属蛋白酶； 肌动蛋白类； 甲状旁腺激素肽（1-34）

　　［Abstract］Objective: To study the intervention effect of advanced glycation end?products (AGEs) on hyperglycemia induced transdifferentiation in NRK?52E cells. Methods: Four groups of NRK?52E cells were established: blank control group (group CON, was given no glucose and no intervention), high glucose group (group HG, given 25mmol/L of glucose), AGEs treated group (group AGE, given 100 mg/L of AGEs), and AGEs plus high glucose treated group (group HG?AGE, given 100 mg/L of AGEs plus 25 mmol/L of glucose), and Western blot was carried out to determine the expression of transforming growth factor β1 (TGF?β1),  typeⅠcollagen, metalloprotease 2 (MMP2), smooth muscle actin α (α?SMA), and parathyroid hormone?related peptide (PTHrP) in these cells after 72 h of reaction.Active oxygen(ROS) contents were detected by using CM2H2DCFDA kit. Results: The expression of TGF?β1, typeⅠcollagen, MMP2, α?SMA and PTHrP were up?regulated by glucose of high concentration; AGEs up?regulated TGF?β1, typeⅠcollagen, MMP2, α?SMA, and PTHrP under high glucose condition, and increased ROS content. Conclusion: AGEs could increase transdifferentiation induced by hyperglycemia in NRK?52E cells.

　　［Key words］ glycosylation end products, advanced; NRK?52E; glucose; transdifferentiation; receptors, transforming growth factor beta; collagen type I; matrix matalloproteinases; actins; teriparatide
   
　　晚期糖基化终产物（AGEs）在糖尿病并发症的发生、中起着重要的作用。肾小管上皮细胞转分化是肾脏纤维化的重要病理基础，研究发现，肾脏纤维化是糖尿病肾病预后转归的主要影响因素[1]，但糖尿病对肾小管导管上皮细胞的影响研究并不清晰。2009年4～7月用AGEs作用在高葡萄糖状态下大鼠肾小管导管上皮细胞株NRK?52E中，观察调控肾小管导管上皮细胞转分化的转化因子β1（TGF?β1）、Ⅰ型胶原、金属蛋白酶2（MMP2）、α平滑肌肌动蛋白（α?SMA）以及甲状旁腺素相关肽（PTHrP）的表达，以阐明AGEs与高糖条件对肾小管导管上皮细胞转分化的影响。

　　1  材料和方法

　　1.1  细胞培养 

　　大鼠肾小管导管上皮细胞株NRK?52E购自中科院细胞库，培养基DMEM培养液（美国GIBCO公司），加入10 ml进口胎牛血清（BSA）（Sigma，USA）、1 ml双抗（青、链霉素各100单位/ml）、1 mmol/L乙二胺四乙酸。每周传代2～3次。

　　1.2  AGEs制备、纯化及鉴定
 
　　取50 g/L BSA及0.5 mmol/L D-葡萄糖溶于0.2 mmol/L的缓冲液中，加入蛋白抑制剂（1.5 mmol/L苯甲磺酰氟及0.5 mmol/L乙烯二胺四乙酸钠），0.22 μm滤器过滤，37 ℃培养箱孵育90 d。AGEs采用AGEs?BSA荧光光谱扫描鉴定，AGEs?BSA激发高峰位于360 nm，发射高峰位于430 nm，最终浓度为90.52 U/mg。

　　1.3  实验分组与处理 

　　分4组：空白对照组（control）为无糖培养基，高糖组含25 mmol/L葡萄糖DMEM培养基，AGEs干预组在无糖的DMEM培养基中应用100 mg/L AGEs干预，高糖AGEs干预组在25 mmol/L葡萄糖培养基中应用100 mg/L AGEs干预。所有分组均在37 ℃，5% CO2条件下培养72 h，每孔细胞均为每24 h换液1次。

　　1.4  Western blot 检测蛋白表达
 
　　常规细胞裂解获取蛋白后，与预染蛋白marker一起上样,经分离胶和浓缩胶进行聚丙烯酰胺胶凝体电泳电离，后将蛋白质电转印到转印膜聚偏二氟乙烯（PVDF膜）上，将膜放入含100 g/L脱脂奶粉的TBST中封闭，4 ℃过夜，然后与一抗（PTHrP、Ⅰ型胶原均购置美国Santa cruz公司，TGF?β1、MMP2购置于英国ABCam公司，α?SMA购置于美国Dako公司）分别按1∶100、1∶75、1∶125、1∶75、1∶50的比例室温孵育90 min，α平滑肌肌动蛋白及Ⅰ型胶原4 ℃，过夜。用TBST液洗膜5 min，3次，PVDF膜分别与辣根过氧化物酶标记的相应二抗(1∶1 000)室温孵育45 min后，用Tris 缓冲液洗膜3次，每次5 min。用ECL显色试剂盒显示目的条带。

　　1.5  活性氧（ROS）检测 

　　各组细胞加入10 μl 的1mmol/ L CM2H2DCFDA（美国Invitrogen 公司，终浓度为10 μmol/L) 染色液, 37 ℃避光孵育30 min,离心，PBS 洗2次，重悬于1 ml 含10 %BSA的DMEM培养液中。用BioTek 公司全自动定量绘图酶标仪检测OD值, 激发波长485 nm，发射波长528 nm。

　　1.6  统计学处理 

　　所有试验均重复3次以上，Western blot图片检测采用Gel.Doc?It imaging system扫描分析仪扫描凝胶图谱，采用Total Lab分析软件对条带进行密度扫描分析。统计学处理采用SPSS 11.5统计软件，采用One?Way ANOVA?SNK法比较总体和组间差异。

　　2  结果

　　2.1  AGEs对NRK?52E细胞株中转化因子的影响 

　　结果（图1）提示，AGEs能显著促进高浓度葡萄糖状态下TGF?β1、Ⅰ型胶原、MMP2、α?SMA以及PTHrP的表达。

　　2.2  AGEs对高糖诱导NRK?52E细胞株ROS含量的影响 

　　结果（图2）提示AGEs能显著促进高浓度葡萄糖状态ROS含量水平。

　　3  讨论
    　　
　　细胞转分化是普遍存在的一种细胞分化过程，目前发现细胞转分化参与糖尿病许多慢性并发症的病程[1]。既往研究已经明确，含α?SMA的肾小管上皮细胞是糖尿病肾病纤维化主要病理基础，是糖尿病肾功能衰竭的重要原因之一[2]。本研究提示，在高浓度葡萄糖浓度作用72 h后， NRK?52E细胞中TGF?β1、Ⅰ型胶原、MMP2、α?SMA以及PTHrP表达水平均显著上调。高浓度葡萄糖通过诱导肾小管导管上皮转分化，主要通过上调TGF?β1、Ⅰ型胶原、MMP2、α?SMA以及PTHrP等蛋白水平，从而加重肾小球硬化及肾间质纤维化[3～6]。本结果提示，AGEs同样可以上注：与空白对照组比较，(1)P＜0.05， (2)P＜0.01；与高糖组比较，(3)P＜0.05，(4)P＜0.01；与AGEs干预组比较，(5)P＜0.01，(6)P＜0.05。

　　调TGF?β1、α?SMA以及PTHrP表达，虽然Ⅰ型胶原及MMP2与空白对照组比较没有显著改变，但在高糖状态下，其表达显著上调，提示AGEs在高糖状态下可能通过TGF?β1、Ⅰ型胶原、MMP2、α?SMA以及PTHrP等多种蛋白水平上调，参与糖尿病肾小管导管上皮转分化病程。在进一步研究中发现，AGEs同时能显著提高高糖状态下NRK?52E细胞株ROS含量，由于氧化应激是诱导肾小管导管上皮转分化的重要因子[7]，此结果也进一步验证了AGEs可能加剧高糖状态下肾小管导管上皮细胞转分化的进程。
      
　　综上所述，AGEs在高糖状态下可以显著促进NRK?52E细胞转分化作用，而其机制可能依赖于氧化应激作用。

【】
  　　[1]Sanchez AP, Sharma K. Transcription factors in the pathogenesis of diabetic nephropathy[J]. Expert Rev Mol Med, 2009(11):13-18.

　　[2]Simonson MS. Phenotypic transitions and fibrosis in diabetic nephropathy[J]. Kidney Int, 2007(9):846-854.

　　[3]Lo CS, Chen CH, Hsieh TJ, et al. Local action of endogenous renal tubular atrial natriuretic peptide[J]. J Cell Physiol, 2009(3):776-786.

　　[4]Hills CE, Al?Rasheed N, Al?Rasheed N, et al. C?peptide reverses TGF?beta1?induced changes in renal proximal tubular cells: implications for treatment of diabetic nephropathy[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2009(3):F614-621.

　　[5]Holian J, Qi W, Kelly DJ, et al. Role of Kruppel?like factor 6 in transforming growth factor?beta1?induced epithelial?mesenchymal transition of proximal tubule cells[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2008(5):F1388-1396.

　　[6]Li H, Liu D, Zhao CQ, et al. High glucose promotes collagen synthesis by cultured cells from rat cervical posterior longitudinal ligament via transforming growth factor?beta1[J]. Eur Spine J, 2008(6):873-881.

　　[7]Manabe E, Handa O, Naito Y, et al. Astaxanthin protects mesangial cells from hyperglycemia?induced oxidative signaling[J]. J Cell Biochem, 2008(6):1925-1937.