圆形纸层析法鉴定转氨基作用的实验改进

【关键词】  实验室技术和方法 氨基酸类 展层剂 迁移率

　　传统实验中常用的苯酚是一种有毒物质，有强烈的刺激气味，对皮肤有较强的腐蚀性，而且价格较贵。2007年6月通过不断的比较与反复试验，将实验中原有的苯酚和水改进为无水乙醇∶水∶尿素的配方，目的在于降低实验试剂对人体的危害，简化实验步骤，降低实验成本。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　新鲜猪肝组织1 g、1％谷氨酸溶液、1％丙酮酸溶液、0.25％碘乙酸溶液、0.1％丙氨酸、0.01 mol/L（pH7.4）磷酸盐缓冲液、0.1％茚三酮乙醇溶液、原展层剂（苯酚、水）、新展层剂（无水乙醇、水、尿素）。

　　1.2  实验方法

　　1.2.1  肝匀浆制备 

　　取新鲜猪肝1 g置于研钵中研碎，加预冷的0.01 mol／L（pH7.4）的磷酸盐缓冲液4 ml，磨成匀浆。

　　1.2.2  转氨基反应 

　　取2支试管，分别标记为测定管和对照管，测定管内加入肝匀浆10滴，对照管内加入煮沸过的肝匀浆10滴，然后两支管内都依次加入0.25％碘乙酸5滴、1％谷氨酸10滴、1％丙酮酸钠10滴，在40 ℃水浴箱中保温10 min，加入5％三氯醋酸2滴，最后在沸水中加热5 min冷却后，离心5 min，取上清液备用。

　　1.2.3  标记划线
 
　　取圆形滤纸（直径12 cm）8张，用铅笔从圆心画长度各1 cm的端点作为点样处，在各点对应的滤纸边缘标上“谷”、“丙”、“对”、“测”字样。

　　1.2.4  点样 

　　取4根毛细管，用顶端分别沾取测定管、对照管、0.1％谷氨酸、0.1％丙氨酸样品液，在滤纸相应点样处点样，每处点2次。

　　1.2.5  层析和显色 

　　在8个直径为5 cm的表面皿中分别加入4种不同的展层剂，即苯酚∶水（4∶1）和无水乙醇∶水∶尿素（分别为：80∶20∶0.5、70∶30∶0.5、60∶40∶0.5三种比例），每种展层剂平行做两份。将表面皿置于直径为10cm培养皿正中，把滤纸平放在培养皿上，使灯芯浸入展层溶剂中，取另一同样大小的培养皿反向盖上，溶剂将沿灯芯上升到滤纸，并向四周扩散，待溶剂前沿扩散至滤纸边缘约1 cm时，取出滤纸，用铅笔划出溶剂前后，在烤箱中烤干。由于无水乙醇∶水∶尿素展层剂中直接加入了茚三酮，故从烤箱中取出的6张滤纸上有紫色的弧形色斑；而原配方的展层剂中没有加入茚三酮，故从烤箱中拿出的滤纸要喷0.1％茚三酮乙醇溶液，再放入烤箱中第二次烤干，才出现紫色的弧形色斑。用铅笔描出色斑轮廓，迁移率Rf值，取两份平行结果的平均值。

　　2  结果

　　经过转氨基作用后，谷氨酸与丙氨酸在四种展层剂中的迁移率见表1。从8张滤纸的层析图谱结果看到，苯酚∶水和乙醇∶水∶尿素（80∶20∶0.5）这4张滤纸上，氨基酸分离效果较为明显，而乙醇∶水∶尿素（70∶30∶0.5）和乙醇∶水∶尿素（60∶40∶0.5）这4张滤纸的氨基酸无法分离。表1  两种氨基酸在四种配方中的迁移率（略）

　　3  讨论

　　3.1  纸层析图谱和迁移率
    　　
　　从4张能分离氨基酸的纸层析图谱结果可以看到，对照管中没有发生转氨基作用，只有一个色斑，而测定管中发生了转氨基作用，有两个色斑。

　　从谷氨酸和丙氨酸的点样色斑相比较得出，距点样处近的是谷氨酸，距点样处远的是丙氨酸。4张纸层析图谱的色斑都分得很明显，证明新旧两种配方的展层剂均能较好的分离氨基酸。从表1的结果也可看到，通过两种不同配方的展层剂分离出来的氨基酸迁移率基本相同，说明用新配方制成的展层剂也能达到分离氨基酸的目的，而且效果很好。

　　3.2  原有展层剂中使用苯酚的缺点

　　原有展层剂中的有机溶剂苯酚（C6H5OH）主要有以下缺点。（1）苯酚的毒性和腐蚀性对皮肤和黏膜有刺激和致坏死的作用，浓苯酚溶液使皮肤坏死而硬化，先白而后红，接触处形成不化脓的干痂。 吸入苯酚中毒后对肝、肾和心肌都受损害。（2）苯酚作为实验试剂价格贵。由于腐蚀性极强［1］，可引起严重灼伤，操作时应戴手套及防护镜等，所有操作均应在通风橱中进行；而且苯酚在低温下呈固态；实验前，需要在水浴中加热数小时才会溶解，现配现用，随配随用［2］，这些都给实验的操作带来不方便；（3）有较强的生物富集作用，对环境污染较大［3］。

　　3.3  新展层剂中使用乙醇的优点
    　　
　　新展层剂的成分为乙醇、水和尿素，比较原有的展层剂，新配方具有以下几个优点：(1)安全无毒，没有腐蚀性，对人体没有副作用；(2)与苯酚相比较，乙醇价格便宜，由于没有腐蚀性，且易挥发，在实验操作中，无须戴手套，也不用在通风橱中进行，这些都大大的简化了实验的操作过程，缩短了实验时间，给实验人员带来了极大的方便。

　　3.4  显色方法比较

　　原实验中的展层剂里没有加入茚三酮，故等滤纸干后要将茚三酮乙醇溶液喷在滤纸上显色，在这个操作过程中茚三酮的量无法固定，会使茚三酮很难均匀的喷在滤纸上，色斑显色不均匀，易扩散［4］，甚至会被冲散，使得滤纸表面显得很不干净，影响Rf值的测定。贵阳医学院学报  33卷    4期王筑婷等  圆形纸层析法鉴定转氨基作用的实验改进为了克服传统喷雾显色造成的重现性差，本实验改进了显色方法，将一定量的茚三酮溶解于展层剂中，在层析过程中，茚三酮随展层剂沿滤纸向四周扩散，由于固定了显色剂的量［5］，茚三酮与α－氨基酸共热，生成还原型水合茚三酮，还原型水合茚三酮再与茚三酮反应生成蓝紫色化合物［6］，故从烤箱中取出滤纸后能看见蓝紫色色斑均匀分布在滤纸上，显色效果较好，滤纸表面比较干净，利于Rf值的测定，大大缩短了实验时间，使操作更简单，效果也很好。
    　　
　　综上所述，用无水乙醇、水、尿素按照80∶20∶0.5的比例配制的新展层剂，可以代替原有的苯酚和水的展层剂，同样能够较好的分离氨基酸，对人体没有任何毒性和腐蚀性，简化了实验步骤；另外，将茚三酮加入新展层剂中，能够更好的显色，实验时间大大缩短，优化了实验结果，达到了改进实验的目的。

【】
  　　［1］榻金彩，周桂. 对“植物体内的转氨基作用”实验的改进［J］.生物学通报，2006（1）：50-50.

　　［2］杨培俊，秦峰秀. 几种层析液对滤纸圆盘分离叶绿体色素的影响［J］.生物学通报，2007（9）：52-52.

　　［3］星炯浩，张运陶. 卤代酚对水生梨形四膜虫急锐毒性的QSAR研究［J］.机与应用化学，2007（1）：87-87.

　　［4］陈海军，林亲录，王婧，等.γ－氨基丁酸测定方法的研究［J］.食品科技，2007（5）：236-236.

　　［5］李海星，江英英，曹郁生. 产γ－氨基丁酸乳酸菌的筛选及初步鉴定［J］.天然产物研究与开发，2007（3）：457-457.

　　［6］张丽萍，李伟辉，马晓贝. 啤酒中α－氨基酸含量的分析［J］.酿酒科技，2007（7）：135-135.