黄芪、赤芍对小鼠免疫性肝损伤的保护作用
作者：陈英利， 邢杰， 吕跃山，于洋
【摘要】 目的： 探讨黄芪、赤芍注射液对卡介苗（Bacillus Calmette Guerin,BCG)和脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）诱导的小鼠免疫性肝损伤模型的保护作用。方法： 采用静脉注射BCG和LPS制备小鼠免疫性肝损伤模型，观察黄芪、赤芍注射液单用及两药配伍对小鼠免疫性肝损伤的影响，检测血清谷丙转氨酶(ALT) 、谷草转氨酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）及小鼠肝组织超氧化物歧化酶（SOD）及丙二醛（MDA）的含量。结果： 黄芪、赤芍注射液及二者配伍应用均显著降低免疫性肝损伤小鼠血清ALT 、AST、LDH含量，明显提高肝组织SOD活性，降低MDA活性，配伍用药的小鼠ALT、AST、LDH、SOD、MDA五项指标变化均优于黄芪注射液单用（P<0.05、P<0.05、P<0.05、P<0.01、P>0.05）、优于赤芍注射液单用（P<0.01、P>0.05、P<0.05、P<0.01、P<0.05）。结论： 黄芪、赤芍注射液对BCG和LPS所致免疫性肝损伤有保护性作用, 黄芪注射液配伍赤芍注射液对免疫性肝损伤保护性作用优于两药单用。
【关键词】 免疫性肝损伤 黄芪 赤芍 小鼠
［Abstract］ Objective: to study the protective effect of milkvetch root injection, red peony root injection and their combination to mouse liver injury induced by bacillus calmettc?guerin vaccine (BCG) and Lipopolysaccharide (LPS). Methods: The immunologically hepatic damage models were induced with injection of BCG+LPS. After the injection of milkvetch root only, red peony root only, or their combination, the recovery of acute liver injury were observed by measuring serum levels of ALT, AST, LDH and superoxide dismutase (SOD) activity, and malond iadehyde (MDA). Results: Milkvetch root injection, red peony root injection, and their combination significantly decreased the levels of serum ALT, AST, LDH and MDA, but enhanced SOD activity in the liver, and the the curative results (indicated as levels of ALT, AST, LDH, SOD, MDA）of combination injection significantly excelled those of both milkvetch root injection (P<0.05, P<0.05, P<0.05, P<0.01, P﹥0.05）alone or red peony root injection（P<0.01, P<0.01, P<0.05, P<0.01, P<0.05）alone．Conclusions: Milkvetch root injection and red peony root injection can protect liver from acute injury induced by BCG+LPS in mice. The combined use of milkvetch root injection and red peony root injection can produce significantly beter protective effect than their sigle use respectively.
［Key words］ liver injury of immunity; Astragalus membranaceus; Radix Paeoniae Rubra; mice
肝脏担负着物质代谢和解毒的功能，是机体重要的器官，因而也易受到病毒、细菌、酒精等攻击，诱发肝脏损伤。肝损伤时肝枯否细胞的激活和各种炎症介质、细胞因子和氧自由基、一氧化氮等物质大量产生，导致炎症反应的发生。2006年选择毒性低，价廉的常用传统中药黄芪与赤芍对免疫性肝损伤保护作用进行研究。黄芪活性成分黄芪甙具有抑制脂氧化酶,减少脂多糖(LPS)的生成,提高肝脏谷胱苷肽(GSH)含量，抗自由基，调节代谢，保护线粒体,尤其在调节免疫、抗肿瘤、抗病毒、改善肝脏供血等方面有重要作用[1，2]。有报道赤芍对乙型肝炎患者肝脏损害有保护作用[3]。单药黄芪及赤芍对动物免疫性肝损伤的保护作用国内均有报道，黄芪与赤芍二者联合用药的效果及机制未见报道，本研究使用卡介菌（BCG）和脂多糖（LPS）诱导小鼠免疫性肝损伤模型，选择血清酶学测定及超氧化物歧化酶（SOD）、肝脏脂质过氧化物丙二醛(MDA)为测定指标，观察黄芪注射液、赤芍注射液联合应用对免疫性肝损伤的保护作用。
１ 材料与方法
１．１ 材料
1.1.1 动物
昆明系雄性小鼠，5～8 周龄，体重（２０±２）g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。
1.1.2 试剂
BCG由卫生部生物制品研究所提供，LPS购自Sigma公司，黄芪注射和赤芍注射液为成都地奥九泓制药厂药品，SOD、MDA试剂盒为南京建成生物工程公司产品，谷丙转氨酶(ALT) 、谷草转氨酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）试剂购于北京中生生物工程高科技公司。
1.1.3 仪器
Spectra MAX 190酶标仪、日立7600-020全自动生化分析仪。
1.2 方法
1.2.1 分组
60只小鼠随机分为5组，对照组、模型组、黄芪组、赤芍组、黄芪赤芍联合组。对照组腹腔注射性理盐水15 ml/kg，模型组和三个给药组建立免疫性肝损伤模型。
1.2.2 造模
鼠均经尾静脉注射 BCG 1 mg(0.2 ml)，3 h后，给药组分别腹腔注射相应药物(黄芪15 ml/kg，或赤芍15 ml/kg，或黄芪和赤芍各7 ml/kg），连续10 d。最后1次给药3 h后，经尾静脉注射LPS 10 μg（0.2 ml），禁食不禁水，5 h后，眼眶取血，分离血清，同时脱颈椎处死小鼠，迅速取出肝右叶组织制备成匀浆测MDA、SOD。
1.3 血清酶活性测定
血清ALT，AST，LDH活性测定用日立7600-020全自动生化分析仪测定；MDA和SOD的含量测定，严格按试剂盒说明书操作。
1.4 统计学处理
实验数据用SPSS13.0统计软件进行方差分析，实验数据以x±s表示。
2 结果
2.1 血清ALT、AST及LDH 模型组与对照组比较，血清中ALT、AST和LDH升高，表明造模型成功。三个用药组与模型组比较各项指标均有显著性差异（P＜0.05，P＜0.01），说明黄芪注射液与赤芍注射液均能减少肝细胞内酶的逸出，对肝细胞有较明显的保护作用；黄芪组强于赤芍组（P＜0.01）,联合组作用更显著，见表1。表1 各组小鼠血清ALT、AST及LDH水平（略）注：与对照组比较，（1）P＜0.05，（2）P＜0.01；与模型组比较，（3）P＜0.05，（4）P＜0.01；与黄芪组比较，（5）P＜0.05；与赤芍组比较，（6）P＜0.05，（7）P＜0.01。
2.2 肝组织SOD及MDA 模型组小鼠肝匀浆SOD水平低于对照组（P＜0.01），MDA含量高于对照组（P＜0.05），表明造模成功。黄芪注射液与赤勺注射液均能提高肝组织SOD活力，减少MDA含量，见表2。表2 各组小鼠肝组织SOD及MDA水平（略）注：与对照组比较，（1）P＜0.05，（2）P＜0.01；与模型组比较，（3）P＜0.05，（4）P＜0.01；与黄芪组比较（5）P＜0.01；与赤芍组比较（6）P＜0.05，（7）P＜0.01。
3 讨论
多数学者认为慢性病毒性肝炎不是肝炎病毒对肝细胞的直接损伤，而是肝炎病毒侵入肝细胞后，激发人体免疫应答引起免疫性肝损伤。微量的BCG和LPS可诱导小鼠免疫性肝损伤模型类似于人类肝炎发生的病理生理过程， BCG首先致敏T淋巴细胞，特别是大量致敏肝内枯否细胞，使巨噬细胞聚集于肝脏，在注射LPS后激活致敏状态的细胞，使其释放大量细胞因子，如一氧化氮、肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素(IL)、自由基和白三烯等，进一步引起肝脏免疫损伤，因此是筛选肝病药物较为理想的模型之一[7]。
机体通过酶系统与非酶系统产生自由基，自由基攻击生物膜中的不饱和脂肪酸引发脂质过氧化作用，产生脂质过氧化物，如MDA，它能改变酶的功能，引起基因调控及表达错误，最终导致肝细胞变性、坏死。因此，MDA是体内脂质过氧化反应终产物，其水平的改变能间接地反映由于自由基损伤机体而引发的脂质过氧化反应情况。血清ALT、AST为氨基酸代谢中的重要酶,存在于肝细胞内。肝细胞损伤时，ALT和AST可逸出细胞外而进入血循环，故血清ALT、AST含量测定是反映肝损伤的灵敏指标[8]。本实验注射BCG和LPS复制免疫性肝损伤模型组小鼠血清ALT、AST和肝组织MDA活性升高，自身免疫性肝损伤的动物模型。
黄芪注射液或赤芍注射液治疗免疫性肝损伤各组小鼠的血清ALT、AST显著降低，与模型组比有显著性统计意义，提示黄芪、赤芍注射液对免疫性肝损伤均有保护作用。两药配伍组的各项检测指标均接近对照组，与黄芪组、赤芍组比较也有显著性意义，说明黄芪注射液和赤芍注射液联合应用产生了药物协同作用。黄芪可促进树突状细胞成熟，递呈抗原能力增强，促进B细胞增殖分化为浆细胞合成分泌抗体[9]，增强体液免疫；同时诱导IL?2的活性，促进生成IFN，IL?2活化T细胞，增强细胞免疫，降低细胞Fas抗原FasL表达，减少肝细胞的凋亡[10]。报道认为黄芪中富含的皂普、异黄酮类化合物、多种氨基酸及硒元素等，与黄芪保护免疫性肝损伤的作用有关[11]。本研究配伍用药的各项检测指标药效优于单药使用，其肝保护作用机制可能与黄芪清除自由基、提高抗氧化酶活性和免疫调节等作用相关；也可能与赤芍所具有调节T细胞的功能，促进IL?3的活性升高，改善肝脏血液循环，清除免疫复合物的积聚及损伤作用，双向调节机体免疫功能，抑制乙型肝炎病毒的复制作用有关。两药的协同作用机理、黄芪注射液与赤芍注射液1∶1配伍是否最佳剂量仍有待进一步研究。
【文献】
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