糖尿病大鼠肾脏PAI?1、TIMP?1表达的变化

                     作者：谢汝佳，孙笛，张晓林，杨婷，韩冰，杨勤

【摘要】  　　目的： 动态观察纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI?1）和金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP?1）在糖尿病大鼠肾脏中的表达，探讨PAI?1及TIMP?1在糖尿病肾病（DN）肾纤维化发生、过程中的作用。方法： 链脲菌素（STZ）诱导大鼠糖尿病肾病，免疫组织化学的方法动态观察糖尿病肾病发生、发展过程中大鼠肾脏PAI?1、TIMP?1及纤维连接蛋白（FN）表达。 结果： PAI?1、TIMP?1及FN表达从糖尿病2周起较正常对照组明显增多（P<0.01）, PAI?1和TIMP?1阳性表达主要位于肾小管上皮细胞胞浆内，FN阳性表达主要位于肾小管间质和肾小球，且随着糖尿病进展有逐渐增加的趋势。结论： PAI?1和TIMP?1在肾小管上皮细胞的高表达可能参与了糖尿病肾病过程中肾纤维化的形成。

【关键词】  糖尿病肾病 纤溶酶原激活物抑制物-1 金属蛋白酶1组织抑制剂 肾 大鼠 Wistar

　　［Abstract］ Objective: To observe the expression changes of plasminogen activator inhibitor?1 (PAI?1) and tissue inhibitor of metalloproteinase?1(TIMP?1) in kidney of diabetic nephropathy rats, and to explore the role of PAI?1 and TIMP?1 in the development of renal fibrosis of diabetic nephropathy (DP). Methods: DP in rats was induced by tail intravenous injection of streptozocin (STZ). The expression of PAI?1，TIMP?1 and fibronection(FN) protein were examined with  immunohistochemical technique.Results: Expression of PAI?1,TIMP?1 and FN in kidney of diabetic rats began to increase in the second week of diabetes; PAI?1 and TIMP?1mainly expressed in intracytoplasm of renal tubular epithelial cells, while FN mainly expressed in renal tubule matrix and glomerului; Their expression showed a tendency of increasing along with the progression of diabetes. Conclusions: The high expression of PAI?1 and TIMP?1 in renal tubular epithelial cells might be involved in renal fibrosis of DP.

　　［Key words］ diabetic nephropathies; plasminogen activator inhibitor?1; tissue?inhibitor of metalloproteinase?1; kedney; rats,Wistar
  
　　近年来的研究发现，细胞外基质（extracellular matrix,ECM）产生增加和（或）降解减少在肾纤维化发生和发展的过程中具有重要作用[1]。ECM的降解酶系主要有纤溶酶原激活物（PA）、纤溶酶系统和基质金属蛋白酶家族（MMPs），而纤溶酶原激活物抑制物-1（PAI?1）和金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP?1）分别是PA、纤溶酶系统和MMPs家族的特异性抑制剂，它们对ECM的代谢以及组织结构的改建具有十分重要的作用。研究发现PAI?1和TIMP?1的表达上调可能与糖尿病肾病时ECM增多、基底膜增厚有直接关系[2,3]。本实验以糖尿病大鼠为动物模型，动态观察糖尿病2周、4周、8周、16周大鼠肾脏PAI?1、TIMP?1及FN表达的变化，从ECM代谢的角度探讨PAI?1和TIMP?1在糖尿病肾病肾纤维化发病机制中的作用。

　　1  材料和方法

　　1．1  试剂

    链脲菌素购自Sigma 公司，兔抗鼠多克隆 PAI?1、TIMP?1和FN抗体、免疫组织化学SABC 试剂盒及DAB显色剂均购自武汉博士德公司，血糖、肌酐、尿蛋白检测试剂盒购自北京迈克公司。

　　1．2  动物分组及动物模型

　　雄性Wistar 大鼠50 只,体重180～220 g ,由贵阳医学院实验动物中心提供。动物随机分为5 组,每组10 只: 正常对照组，糖尿病2周组，糖尿病4周组，糖尿病8周组，糖尿病16周组。用0.01 mol/L、pH 4.5 柠檬酸钠缓冲液将链脲菌素（STZ）配成5 %的溶液,糖尿病组大鼠按55 mg/kg剂量单次尾静脉注射, 对照组大鼠尾静脉注射0.2ml等量柠檬酸钠缓冲液。48 h 后尾静脉采血,用Glucometer4 型血糖仪(Baer 公司) 测血糖值,大于或等于16.7 mmol/ L 者确定为糖尿病模型大鼠。

　　1．3  观察指标及方法

　　1．3．1  尿、血、肾脏组织采集及生化检测 

　　糖尿病大鼠分别于实验2周、4 周、8 周和16 周末称体重，正常对照组大鼠于16周末称体重；代谢笼收集记录24 h 尿量，-20 ℃保存，考马斯亮兰法测定尿蛋白（urine protein ,UP）。股动脉放血处死, 收集血液，1 500 r/min 离心10 min，分离血清，-20 ℃保存，氧化酶法测定血糖(BG)，碱性苦味酸法测血肌酐(Scr)。分离肾脏，称肾重，用冷生理盐水灌洗除去肾脏血管内血液,然后用4%多聚甲醛固定,观察病理形态和免疫组织化学检测。

　　1．3．2  肾脏病理组织学检查
 
　　4 %多聚甲醛固定的肾脏组织石蜡包埋，常规组织切片, HE和PAS染色，观察肾小球、肾小管病理变化。

　　1．3．3  肾组织免疫组织化学检测 

　　切片常规脱蜡水化，3%H2O2处理，微波修复抗原，加封闭液后，分别加兔抗鼠PAI?1多克隆抗体 (工作浓度为1∶80)、兔抗鼠TIMP?1多克隆抗体 (工作浓度为1∶30)和兔抗鼠FN多克隆抗体 (工作浓度为1∶30)，4 ℃过夜。次日加生物素化羊抗兔IgG，在37 ℃孵育30 min，加SABC工作液，DAB显色，苏木素复染。阴性对照以PBS 缓冲液代替一抗。随机抽取5个高倍镜下视野，观察阳性表达的定位，PAI?1和TIMP?1的表达程度以阳性表达肾小管数占视野下肾小管总数的百分比表示，FN的表达［4］方法计数。

　　1．4  统计学处理 

　　实验数据以x ±s 表示,用SPSS 统计软件(11. 0 版) 进行组间方差分析, P<0.05表示有显著性差异。　

　　2  结果

　　2.1  血糖浓度、肾重与体重比、血肌酐、尿蛋白
    　　
　　由表1可见， STZ诱导糖尿病各组大鼠的血糖均较正常对照组明显升高（P<0.01），从2 周到16 周一直保持在较高水平，但糖尿病各组大鼠的血糖水平无显著性差异。大鼠肾重与体重之比在STZ诱导的各组糖尿病大鼠也较正常组明显增加（P<0.05），且随着糖尿病进展逐渐加重，16周组DN大鼠肾重与体重之比较2周组显著增加（P<0.05）；血肌酐水平在糖尿病各组大鼠也较正常组明显增高（P<0.01），以4周组明显；24 h 尿蛋白从2周起明显增多（P<0.01），以4周最为明显，且随糖尿病病程进展一直保持在较高水平。

　　2.2  肾脏的病理形态
    　　
　　HE及PAS染色镜下观察可见，正常组大鼠肾小球及肾小管结构清晰，肾小管上皮细胞排列整齐，基底膜完整，未发现与年龄相关的病理变化。STZ诱导糖尿病2周大鼠肾小管出现明显肿胀、变性；4周大鼠肾脏肾小球细胞增多,部分肾小管出现变性，坏死，炎性细胞浸润；8周后出现肾小球及肾小管纤维结缔组织增生，炎性细胞浸润，且随着糖尿病病程延长病变逐渐加剧。正常组与糖尿病组大鼠肾脏组织学见图1。表1  各组大鼠的血糖浓度、肾重与体重比、血肌酐、尿蛋白水平（略）注：(1)与正常对照组比较,P<0.01; (2)与正常对照组比较,P<0.05;(3)与糖尿病2周组比较，P<0.05。

　　2.3  免疫组织化学结果
    　　
　　正常组大鼠肾脏偶见PAI?1、TIMP?1和FN阳性表达，且表达较弱；而糖尿病组大鼠肾脏PAI?1、TIMP?1及FN表达均较正常对照组明显增多,且阳性表达随着糖尿病进展有逐渐增加的趋势，到糖尿病16周时达到高峰。PAI?1和TIMP?1阳性免疫染色主要分布在肾小管上皮细胞胞浆内，呈棕黄色，而FN阳性表达主要位于肾小管间质和部分肾小球。正常组与糖尿病组大鼠肾脏PAI?1、TIMP?1和FN蛋白表达变化见表2，图2，图3及图4。表2  各组大鼠肾脏PAI?1、TIMP?1及FN蛋白表达（略）注：(1)与正常对照组比较,P<0.01; (2)与糠尿病2周组比较，P<0.05; (3)与糖尿病4周组比较，P<0.01。

　　3  讨论
    　
　　糖尿病肾病以肾小球及肾小管基底膜增厚和肾小球系膜扩大、肾动脉硬化以及肾间质纤维化为特征[5]。研究发现，高糖引起的肾小管上皮细胞和系膜细胞功能改变和ECM积聚在糖尿病肾病病理过程中起重要作用，但其具体机制目前尚未完全阐明。在正常情况下，肾脏内ECM的合成和降解处于动态平衡状态，在某些病理条件下，ECM的合成增加或降解减少，导致ECM在肾脏内聚积，从而产生肾纤维化。
      
　　纤溶酶原、纤溶酶系统和MMPs是肾脏内ECM降解的主要蛋白酶系统[6,7]。纤溶酶原可被组织型和尿激酶型纤溶酶原激活物（t?PA和u?PA）激活为纤溶酶，纤溶酶不仅可降解ECM，而且还可以激活降解ECM的另一种蛋白酶系统——基质金属蛋白酶[8]，从而发挥降解多种ECM成分的作用。PAI?1和TIMP?1分别是纤溶酶原激活物（PA）、纤溶酶系统和MMPs系统的生理性抑制物[9～11]，它们通过抑制纤溶酶原激活物以及MMPs的活性，从而减少ECM成分的降解而引起肾纤维化的发生。李氏等[2]观察到体外培养的大鼠肾脏成纤维细胞在高糖环境下PAI?1 mRNA水平较正常对照组明显增高；而董氏等[12]的实验发现，单侧输尿管梗阻大鼠肾组织中TIMP?1的表达显著增加，这些结果提示PAI?1和TIMP?1可能在肾脏纤维化的发生过程中具有重要作用。
    　　
　　在实验中发现，DN组大鼠肾脏PAI?1和TIMP?1蛋白表达水平明显高于正常对照组，且随糖尿病肾病肾纤维化的进展而持续高水平表达。这种变化趋势与尿肌酐、尿蛋白及病理组织学改变以及FN的变化一致。由于PAI?1是纤溶酶原激活物的特异性抑制剂，DN时增加的PAI?1与PA活性中心的丝氨酸发生不可逆的共价结合，从而抑制PA的活性，使纤溶酶原不能转变成纤溶酶，导致纤维蛋白、FN、LN降解减少。另外，纤溶酶的减少，还可抑制MMPs前体转变成有活性的MMPs，从而失去降解ECM的能力。此外，在本实验还发现，DN组大鼠肾组织中TIMP?1的表达也是明显增加的，增加的TIMP?1能与MMPs 1∶1结合，从而封闭MMPs的锌离子活性中心[13]，使MMPs失活，因此，ECM的降解进一步减少。综上所述，DN时，一方面由于各种致纤维化因素的作用使ECM的合成增加；另一方面，由于PAI?1和TIMP?1的表达上调， 抑制了ECM的降解，使大量ECM沉积在肾组织中，从而促进了肾纤维化的发生和发展。

【】
  　　[1]Roger M Mason,Nadia Abdel Wahab. Extracellular matrix metabolism in diabetic nephropathy[J].J Am Soc Nephrol, 2003 (14): 1358–1373.

　　[2]李海剑，刘章锁，刘书真，等. 罗格列酮对高糖条件下大鼠肾脏成纤维细胞TGF?β1和PAI?1 mRNA表达的影响[J].郑州大学学报（医学版），2007（1）：47-49.

　　[3]欧三桃，陈明. 金属蛋白酶组织抑制因子?1与肾间质纤维化[J]. 医学综述，2004（6）：375-376.

　　[4]郭兵，肖瑛，万昌武，等. 糖尿病大鼠肾小管TGF?β1和MAPK1/3表达的动态观察[J]. 病理生理杂志[J]，2004 （9）：1681-1685.

　　[5]Yashpal S. Kanwar, Jun Wada, Lin Sun, et al. Diabetic nephropathy: mechanisms of renal disease progression[J]. Exp Biol Med, 2008 (233): 4-11.

　　[6]Hyun Soon Lee, Kyung Chul Moon, Chi Young Song, et al. Glycated albumin activates PAI?1 transcription through Smad DNA binding sites in mesangial cells[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2004 (287): 665-672.

　　[7]郭继华，王俊，孟伟，等. 慢性异体肾移植病人肾纤维化组织中MMP?2、TIMP?1、Vimentin、Keratin 免疫组化定量分析[J].新疆医科大学学报，2006 （9）：815-817.

　　[8]Seong H Cho, Chung H Ryu and Chad K Oh. Plasminogen activator inhibitor?1 in the pathogensis of asthma[J]. Exp Biol Med, 2004 (229):138-146.

　　[9]Maxime P Look, Wim L J Putten, Michael J Duffy, et al. Pooled analysis of prognostic impact of urokinase?type plasminogen activator and its Inhibitor PAI?1 in 8 377 breast cancer patients[J]. J Natl Cancer Inst, 2002 (94): 116.

　　[10]Filippo Aucella, Maurizio Margaglione, Mimmo Vigilante, et al. PAI?1 4G/5G and ACE I/D gene polymorphisms and the occurrence of myocardial infarction in patients on intermittent dialysis[J]. Nephrol Dial Transplant, 2003 (18): 1142-1146.

　　[11]黄云剑，张远宁，王沂芹，等. PAI?1和TIMP?1基因在肾小管间质纤维化中的表达及HGF的干预作用[J]. 中国病理生理杂志[J]，2004（9）：1542-1546.

　　[12]董健平，陈香美，师锁柱，等. 金属蛋白酶组织抑制剂1在大鼠肾小管间质损害中的表达及其意义[J].中华肾脏病杂志，2002 （4）：275-279.

　　[13]佘正元,姜翠玲,刘　波,等. 金属蛋白酶组织抑制因子?1在糖尿病肾病患者中的表达[J].中国实验诊断学，2006（11）：1325-1328.