毛细管区带电泳法测定黄连、黄柏炮制前后小檗碱的含量
作者：高言明, 王建科, 李健, 陈飞, 李维勇
【摘要】 目的： 考察黄连、黄柏药材炮制前后小檗碱的含量变化。方法： 采用熔融石英毛细管柱（50 μm×72.5 cm，有效长度64.2 cm）作为分离通道，50 mmol/L Na2HPO4?NaH2PO4 （pH=6.7）-甲醇（2∶1）作为缓冲溶液，运行电压30 kV，毛细管柱温20 ℃，检测波长275 nm。结果： 小檗碱的线性范围为0.010 8 ～ 0.075 6 mg/L,r = 0.999 3，小檗碱在黄连和黄柏中的回收率分别为101.56%、RSD 2.0%和95.6%、RSD 1.32% 。结论： 毛细管区带电泳法简便、准确，重复性好，黄连、黄柏炮制后小檗碱的含量均有降低。
【关键词】 黄连 黄柏 小檗碱 电泳 毛细管
［Abstract］ Objective: To observe content changes of berberine in Coptis chinensis Franc and Phellodenron chinense Schneid before and after processing. Method： A fused quartz capillary（50 μm×72.5 cm，with effective length of 64.2 cm） was used as abstraction tunnel．The running buffer was composed of 50mmol/L Na2HPO4?NaH2PO4 （pH=6.7）-methanol（2∶1）．The applied voltage was 30kv and the capillary temperature was 20℃．The detection wavelength was 275nm. Results： The linear curve for berberine was obtained in the range of 0.010 8 ～ 0.075 6 mg/L,r=0.999 3. The recovery of berberine in Coptis chinensis Franch was 101.56% with RSD of 2.0% and in Phellodenron chinense Schneid was 95.6% with RSD 1.32%. Conclusions： The method is simple, accurate and good in reproducibility. The berberine contents in Coptis chinensis Franc and Phellodenron chinense Schneid decrease after processing.
［Key words］ Coptis chinensis Franch；Phellodenron chinense Schneid；electrophoresis, capillary
中药材炮制目的主要是改变药性，降低副作用，扩大用药范围，而中药材炮制工艺繁多，饮片生产工艺落后，产品的质量标准体系不完善，药理研究还不够深入等缺点[1]。中药材在炮制过程中往往需要加入某些辅料，炮制之后的药材会因辅料中不挥发的附着物使重量增加。因此，在分析炮制前后药材中化学成分时，这些附着物的重量应该被扣除后才能准确被测成分的含量变化。黄连和黄柏药材中的药效成分小檗碱含量的测定方法多采用高效液相色谱法[2，3]或薄层扫描法[4]，采用高效毛细管电泳法进行测定的报道较少。2007年采用高效毛细管电泳法对黄连和黄柏炮制前后小檗碱含量进行了测定。
1 仪器与试药
HP3DCE高效毛细管电泳仪（Agilent公司）DAD检测器，Agilent化学工作站，自动进样器； AE-240双量程分析天平（万分之一和十万分之一，梅特勒-托利多上海有限公司）。盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氢氧化钠均为分析纯、甲醇（分析纯，色谱纯）、水为重蒸馏水，盐酸小檗碱对照品购自药品生物制品检定所（批号0713?9906）。药材黄连、黄柏分别购自贵阳同济堂药店和贵阳鼎茂药行，经贵阳中医学院药学系生药学教研室周汉华副教授鉴定，黄连为毛茛科植物味连Coptis chinensis Franch.的干燥根茎，黄柏为芸香科植物黄皮树Phellodenron chinense Schneid.的干燥树皮。
2 方法与结果
2.1 黄连和黄柏的炮制
酒黄连、姜黄连、萸黄连、盐黄柏分别用生黄连和生黄柏，按2005版《中华人民共和国药典》一部规定进行炮制[5] 。由于经过炮制后的药材重量将会增加（得率P>100%），因此，炮制品的数据均为扣除附着物后计算的结果。计算公式如下：
炮制得率： P=W2W1×100%
W1 ：炮制前干燥至恒重的样品重量；W2：炮制后干燥至恒重的样品重量。黄连和黄柏药材经炮制后的得率：酒制黄连116.81%，吴茱萸制黄连109.69%，姜制黄连111.10%，盐制黄柏101.6%。
2.2 供试品溶液的制备
称取干燥至恒重的各样品粉末约0.1 g ，置索氏提取器中，加入100∶1的甲醇-盐酸约70 ml，水浴加热回流至提取液无色，收集提取液，以甲醇定容至100 ml，摇匀，即得供试品溶液。
2.3 毛细管电泳条件
采用空心石英毛细管柱（河北永年光导纤维厂）50 μm ×72.5 cm，有效长度64.2 cm ；DAD检测器检测波长275 nm，50 mmol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠(pH=6.7)-甲醇（2∶1）的溶液作为缓冲溶液，工作电压30 kV，压力进样3 kPa×10 s，电解质封口1 kPa×5 s，柱温20 ℃。每次进样前依次用浓度为0.1 mol/L的氢氧化钠和缓冲溶液分别冲柱5 min。分离效果见图1。贵阳医学院学报 33卷 4期高言明等 毛细管区带电泳法测定黄连、黄柏炮制前后小檗碱的含量(min)
2.4 标准曲线的制备
精密称取2.70 mg盐酸小檗碱对照品，用甲醇溶解于25 ml容量瓶中，并定容至刻度、摇匀，得浓度为0.108 g/L盐酸小檗碱对照品溶液。分别精密吸取浓度为0.108 g/L的盐酸小檗碱对照品0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 ml于7个5 ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀后分别精密吸取0.5 ml于7个样品小瓶中，按“2.3”项下进行电泳测定。以浓度C为横坐标，峰面积A为纵坐标，线性回归方程：A=556.327 C-0.517 6，r =0.999 3。盐酸小檗碱线性范围为0.010 8 ～ 0.075 6 g/L。
2.5 精密度试验
在9个样品小瓶中分别精密加入同一浓度的对照品溶液0.5 ml，用新的样品小瓶盖盖紧，按“2.3“项下分别进行测定，用峰面积精密度，9次测定结果RSD=1.72％。
2.6 稳定性试验
分别取黄连、黄柏生品提取液各一份，分别在0、2、4、6、8 h测定小檗碱的峰面积，结果黄连、黄柏的RSD值分别为1.46%和1.91%。
2.7 重复性试验
精密称取黄连和黄柏干燥生品粉末样品各5份，每份约0.1 g，按“2.2”项下进行提取，按“2.3”项下进行电泳分离测定。结果黄连、黄柏样品中盐酸小檗碱的平均含量分别为6.22%，RSD = 0.98％；2.40%，RSD=2.10％。
2.8 回收率试验
取盐酸小檗碱平均含量分别为6.22%和2.40%的黄连和黄柏干燥样品粉末各5份，每份约0.05g，再加入一定量的小檗碱对照品溶液，按“2.2”项下进行提取，按“2.3”项下进行测定，结果见表1。表1 盐酸小檗碱回收率测定结果（略）
2.9 样品中盐酸小檗碱测定
称取各干燥至恒重的样品粉末约0.1 g，按“2.2”项下进行提取，按“2.3”项下进行测定，结果见表2。表2 样品中盐酸小檗碱含量测定结果（略）
3 讨论
黄连和黄柏药材经炮制后，其中盐酸小檗碱的含量都有一定程度下降，原因可能是在炮制过程中小檗碱因温度增加而被分解。因此，如要减少小檗碱的损失，炮制方法和温度的控制是值得研究的问题[6]。
高效毛细管电泳采用外标法进行定量分析，通常精密度稍差。若采用内标法，要找到恰当的内标物往往难度较大。本研究在使用外标法的操作过程中进行了一定的改进，如用塑料样品小瓶盖只穿刺进样一次后就不再使用，或精密量取样品溶液于样品小瓶中，使各样品小瓶中的液体样品体积一致；压力进样之后电泳之前，需用电泳介质封口，经上述3项改进后，精密度有了明显改善[7]。
【】
[1]唐永红，麻春恒，潘忠记.炮制盐黄柏新工艺参数优选的研究[J].广西医药，2006（9）:1426-1428.
[2]乔喜芹.HPLC测定黄柏炮制品盐酸小檗碱质量分数[J].哈尔滨商业大学学报，2006（5） ：18-20.
[3]修彦风，徐德生，冯怡，等.不同用量的吴茱萸炮制黄连后成分的比较[J].中草药，2003（4）：320-322.
[4]叶玉兰，赵萍萍，罗泽澜，等.黄连及其炮制品中5种生物碱含量测定[J].中成药，1996（3）：16-17.
[5]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京：化学出版社，2005：214.
[6]徐运安，徐爱良，蒋孟良，等.萸黄连不同炮制方法对其小檗碱含量的影响[J].中医药信息杂志，2005（4）：55-56.
[7]高言明，宋勤，陈惠玲，等.毛细管区带电泳法测定人工种植粗毛淫羊藿中绿原酸的含量[J].药物分析杂志，2006（8）：1088-1089.
