灭蚊真菌贵阳腐霉原生质体的制备和再生研究

【摘要】  目的： 建立贵阳腐霉原生质体的制备和再生系统，为该菌的基因工程和细胞工程改良提供适宜的真菌状态。方法： 对影响原生质体形成的各因素，包括菌龄、消化酶的种类和比例、消化时间以及渗透压稳定剂的成分和浓度进行实验比较。结果： 以1 %纤维素酶与1 %溶壁酶1∶1组合联合脱壁，0.6 mol/L的甘露醇作渗透压稳定剂，酶解采用KPYG2培养基培养52～54 h的贵阳腐霉菌菌丝，消化5 h所获得的原生质体数最多，原生质体浓度可达到6.48×106个/ml；在0.6 mol/L甘露醇作渗透压稳定剂的KPYG2培养基上，原生质体再生率为0.043%。结论： 本实验所的原生质体制备方法可以获得在基因转化或细胞突变诱导所需的原生质体浓度。

【关键词】  真菌； 贵阳腐霉； 原生质体； 生物灭蚊； 渗透压

    ［Abstract］ Objective: To provide a suitable fungal material for protoplast-mediated genetic transformation and mutation induction of Pythium guiyangense Su. Methods: Conditions for the fungal protoplast preparation and regeneration including mycelium incubation time, various compounding of enzymes and osmotic stabilizers were examined. Results: Under the conditions as following: mixture of 1% lywallzyme and 1%cellulose （1:1） as digestive enzyme solution; 0.6mol/L D-Mannitol as osmotic stabilizer, and 5h, of digestive time the obtained protoplast amount reached 6.48×106 each milliliter. A regeneration rate of 0.043% was obtained. Conclusion: A satisfied concentration of P. guiyangense protoplasts can be achieved with the preparation system developed in this research.

    ［Key words］ fungi; Pythium guiyangense Su; protoplasts; mosquito biocontrol; osmotic pressure

    丝状真菌贵阳腐霉（Pythium guiyangense Su）具有灭蚊能力强，繁殖能力快，易于人工培养以及对其他非靶生物相对安全等优点［1］，具有良好的开发前景，但同时也存在着杀虫速度慢，毒力不稳定等缺点，利用基因工程技术和细胞工程技术对该菌株进行改良势在必行，而制备贵阳腐霉的原生质体是重要的基础工作之一。由于不同真菌的细胞壁的成分和结构不一样，其原生质体制备和再生所需要的条件也不一样，需要作大量的实验来总结和筛选适合某一特定真菌的制备条件。2007年5～12月对贵阳腐霉原生质体的制备和再生进行研究，报道如下。

    1  材料与方法

    1.1  菌株  取自贵阳医学院蚊虫生物防治实验室。菌丝在固体培养基上每7 d转种1次，培养温度（25±1 ）℃。

    1.2  培养基  菌丝培养液（KPYG2）：葡萄糖1.5 g/L，酵母1.0 g/L，蛋白胨1.0 g/L，氯化钙0.075 g/L，胆固醇0.02 g/L，玉米油10 g/L。菌丝固体培养基：KPYG2加入琼脂粉10 g/L。再生培养基：用渗透压稳定剂溶解KPYG2各成分，上层含琼脂0.6%，下层含琼脂2%。

    1.3  渗透压稳定剂  氯化钠、硫酸镁为分析纯，山梨醇、甘露醇为生化试剂。

    1.4  酶的种类及酶液的配制  纤维素酶（Cellulase）为中科院上海生化所东风生化技术公司产品，溶壁酶（Lywallzyme）为广东省微生物研究所产品。酶液的配制及除菌采用渗透压稳定剂配制所需浓度酶液，然后用0.22 μm的微孔滤膜除菌，4 ℃保存备用。

    1.5  真菌培养条件  取固体培养基琼脂块1 cm×1 cm（长有菌丝）置于KPYG2中，110 r/min离心，温度（25±1） ℃，培养48～72 h。

    1.6  原生质体的制备  取菌丝约0.1 g于1.5 ml Ep管中，ddH2O洗涤两次、渗透压稳定剂洗涤一次后，加入1 ml酶液，于37 ℃恒温摇床上110 r/min进行酶解。每隔30 min于显微镜下观察一次原生质体的数量。最终酶解混合液经4层擦镜纸过滤到新的1.5 ml Ep管中，滤去菌丝残片。滤液于2 000 r/min离心4 min，原生质体悬于上层，用渗透压稳定剂洗涤3次。以上均为无菌操作，用血细胞计数板计数原生质体。

    1.7  原生质体的再生  取渗透压稳定剂重悬的原生质体涂布于下层固体再生培养基上，再加40～50 ℃上层琼脂培养基3 ml，迅速摇匀，（25±1） ℃温育培养，形成的菌落数为（A）。另取原生质体悬液加10倍无菌蒸馏水，使原生质体破裂，再用同样方法做对照，形成的菌落数为（B）。显微镜下观察总原生质体数为（C）。3～5 d后数菌落，再生率：原生质体再生率＝［（A-B）/C］×100%。

    1.8  统计学处理  原生质体产量取3次试验数据的均值。

    2  结果

    2.1  原生质体产量  酶解3 h，贵阳腐霉原生质体产量达2.98×106个/ml,酶解5 h产量达6.84×106个/ml，如图1。

    2.2  影响贵阳腐霉原生质体形成的因素  以1 %纤维素酶与1 %溶壁酶1∶1组合联合脱壁，采用培养52～54 h的菌丝，0.6 mol/L甘露醇作渗透压稳定剂，酶解时间为5 h。如图2，图3。

　　2.3  贵阳腐霉原生质体形成过程  贵阳腐霉原生质体有两种生成方式，一种是菌丝被酶裂解为小片断，原位形成原生质体；一种是菌丝壁破洞，从顶端膨大释放原生质，形成原生质体。原生质体大小不一，但多数在10～15 μm。如图4，图5。 the tip of digested mycelia压稳定剂的原生质体再生率为0.043 %，以山梨醇为渗透压稳定剂的原生质体再生率为0.019 %，而以氯化钠、硫酸镁做渗透压稳定剂的原生质体再生率为零。

    3  讨论

    自Emerson［2］首次报导得到粗糙脉孢菌的类原生质体结构以来，丝状真菌原生质体的研究在上世纪60年代取得了很大的进步。由于真菌原生质体相对于菌丝来说，具有无细胞壁障碍的优点，在对真菌进行基因工程改良和细胞水平的突变诱导筛选和原生质体融合育种中被广泛应用。特别是近年来，真菌的原生质体已从单纯的实验室研究转向生产具有价值的优良菌株上，以此获得更好的效益［3］。由于不同真菌的细胞壁的成分和结构不一样，原生质体的制备技术也不一样，其中最重要的是消化细胞壁的酶种类和配比以及渗透压稳定剂种类的选择，其次采用的菌丝的天龄和细胞壁的酶解时间也很关键。

    3.1  菌龄  菌丝体的菌龄对原生质体释放的影响主要由壁的成分和结构的变化引起。菌龄短的菌丝体的壁成分相对简单，壁也相对薄些，但并不是菌龄越短，原生质体生成率越高，菌龄过短会造成菌丝量不足，或影响原生质体的再生。不同种类的真菌酶解时最佳菌龄是不同的［4］。本研究显示，培养52～54 h的贵阳腐霉菌丝产生的原生质体量较多，可能因为这个时期的菌丝细胞壁成分和结构最适宜用酶解法制备原生质体。同时，培养52～54 h达到的菌丝量也够用酶解法制备原生质体。

    3.2  脱壁酶  由于不同种属真菌的细胞壁成分和结构不同，所以选择合适的脱壁酶对原生质体的产量至关重要。一般来说，混合酶液比单一酶液的脱壁效果好。贵阳腐霉属卵菌纲，细胞壁的成分主要为纤维素和葡聚糖［4］，针对贵阳腐霉的细胞壁成分，本实验选用了1 %纤维素酶和1 %溶壁酶1∶1配比联合脱壁。

    3.3  酶解时间  实验选用培养52 h的菌丝体制备原生质体，酶解2 h后，每隔1 h取样一次测定。结果显示，随着酶解时间延长，原生质体产量逐渐增加，5 h达最高；再延长酶解时间，原生质体产量没有增加，酶解过夜几乎没有原生质体存在。这可能是因为裂解酶对早期生成的原生质体膜有破坏作用，影响原生质体膜的稳定性，原生质体的不稳定对再生率有不利影响。因此，酶解时间不宜过长，达到所需量的时候，应尽快将酶液去除［5］。

    3.4  渗透压稳定剂  渗透压对所有生物的生长均有很大影响，真菌也是如此，如果渗透压超过一定的限度，则引起环境胁迫，致使真菌死亡［4］。有报道称，氯化钠、硫酸镁等无机盐类和山梨醇、甘露醇等作渗透压稳定剂对于腐霉无效。而本实验采用培养52～54 h的贵阳腐霉菌丝，酶解5 h，以0.6 mol/L的甘露醇作渗透压稳定剂效果最佳，其次为0.6 mol/L山梨醇，另外，用氯化钠作渗透压稳定剂的效果也比较好。这可能是因为醇类比无机盐更能维持原生质体膜的稳定性。

    3.5  再生率  贵阳腐霉原生质体再生率偏低，可能与原生质体所处的生理状态和外界因素有关［6］。贵阳腐霉的菌丝是无隔的，实际是多核细胞，所以酶解形成的原生质体有的有核，有的无核。只有包含完整核和成套细胞器的原生质体才能够再生。故以这类菌丝为材料制备原生质体的再生率比较低。

    　　本研究采用1 %纤维素酶与1 %溶壁酶1∶1组合联合脱壁消化KPYG2培养基培养52～54 h的贵阳腐霉菌丝5 h，用0.6 mol/L甘露醇作渗透压稳定剂所获得的原生质体浓度可达到6.48×106个/ml。这一浓度高于何社辉于1995所获得的大链壶菌原生质体浓度［7］。分析原因，认为一是菌种不同，二是本实验中所用的消化酶效力比较高。本研究成功的制备了贵阳腐霉的原生质体，并初步实现了该原生质体的再生，为后续的转化工作及进一步构建毒力较强的工程菌株奠定了基础。

    　　何社辉1995年曾经报道灭蚊真菌大链壶菌的原生质体制备与再生［7］。贵阳腐霉与大链壶菌同属卵菌纲，但是属于不同的目，亲缘关系比较远，因此本研究结果对腐霉属及其相关真菌原生质体制备有一定的价值。

【】
  ［1］Su Xiao-qing.A new species of Pythium isolated from mosquito larvae and its ITS region of rDNA［J］.Mycosystema,2006（4）:523-528.

［2］Emerson S，Emerson M R.Production,reproduction and reversion of protoplastlike structure in the osmotic strain of Neurospora crassa［J］.Proe Nal Acad Sel USA,1958（44）:668-671.

［3］甘志被，赵学慧.黑曲霉ANS-11原生质体的制备［J］.湖北农业，1994（4）：32-34.

［4］张志光.真菌原生质体技术［M］.长沙：湖南科学技术出版社,2003：2，41，70.

［5］姚婷婷,王正祥.黑曲霉原生质体的制备、再生及转化条件［J］.食品与生物技术学报,2006（4）：116-120.

［6］王伟霞,李福后.茯苓原生质体制备与再生条件研究［J］.菌物研究,2006（4）：65-68.

［7］何社辉,苏晓庆.灭蚊真菌-大链壶菌原生质体形成和再生的研究［J］.真菌学报,1995（3）：196-201.