组织芯片技术研究肺鳞癌高迁移率蛋白A1表达

                         作者：黄薇 何常 杨婷 冉鹏 杨勤 

【摘要】  目的： 应用组织芯片( tissue chip )-组织微阵列( tissue microarray，TMA)技术结合免疫组织化学的方法检测肺鳞癌组织中高迁移率蛋白A1（high mobility group A1，HMGA1)的表达情况,以明确HMGA1蛋白表达与肺鳞癌发生的关系及临床意义。方法: 用组织阵列仪制备组织芯片, 切片后采用免疫组织化学的方法检测组织芯片上25例肺鳞癌肿瘤组织和18例对照组肺组织样本中的HMGA1的表达情况，并分析其表达与各临床病参数之间的相关性。结果: HMGA1蛋白在肺鳞癌组和对照组的阳性表达率分别为68.0 % (17/25)、16.7%(3/18) ,两者比较差异具有显著性(P<0.05) ; HMGA1阳性表达与性别、年龄无关(P>0.05) ,而与淋巴结转移及组织学分级有关(P<0.05) 。结论: 肺鳞癌的发生、可能与HMGA1的表达上调密切相关，HMGA1有望成为肺鳞癌诊治中的1个新的标志物；临床上，检测HMGA1蛋白对判断肺鳞癌的预后和指导可能具有一定的价值。

【关键词】  肺肿瘤; 免疫组织化学； 组织芯片; 高迁移率蛋白A1

    ［Abstract］ Objective: To determine the relationship of high mobility group A1 protein (HMGA1) expression with the development of lung squamous cancer, and its clinical significance. Methods: Tissue chip/tissue microarray (TMA) technique combined with immunohistochemistry method was adopted to detect HMGA1 expression in tissue of lung squamous cancer,and the correlation between HMGA1 protein expression and lung squamous cancer. A series of tissue chips were prepared by using tissue-arrayer. Specimens from 25 cases of lung squamous cancer and 18 cases of control lung tissues were detected immunohistochemically on a tissue chip for HMGA1 protein expression and its correlation to clinic pathological paramter was analyzed statistically. Results: Positive rates of HMGA1 protein was 68.0 % ( 17 /25) and 16.7%(3/18) in lung cance and in lung tissue of control group, respectively, and the difference was significant (P<0.05) ; The positive rates correlated strongly to the lymphoid metastasis and histological classifications of lung cancer (P<0.05) too. No significant relationship was found between HMGA1 and patients′ sex or age (P>0.05). Conclusions: The progression of the lung cancer may relate with the increase of HMGA1 expression. It′s promising for HMGA1 to  become a new marker for diagnosis of lung squamous carcinoma. Clinical detecting  of HMGA1 could help with prognosis and treatment-guiding of lung squamous cancer.

    ［Key words］ lung neoplasms; immunohistochemistry; tissue chip; high mobility group A1

    　　肺癌的生长、浸润和转移是多种因素综合作用的结果, 包含多种原癌基因的激活、抑癌基因的失活和多种细胞因子的结构和功能的异常表达。HMGA1是一种广泛存在于真核生物细胞中非常重要的结构转录因子，它在人体的胚胎发育、肿瘤形成过程中发挥着至关重要作用，近几年研究发现，HMGA1表达与人类肿瘤的发生有关，HMGA1基因被视为癌基因［1］。2007年采用TMA技术结合免疫组织化学的方法检测了25例肺鳞癌肿瘤组织及18例对照组肺组织中HMGA1蛋白的表达,以期验证其在肺鳞癌组织中的表达及与肺鳞癌发生、发展的关系，探讨肺鳞癌发生的分子生物学机制，为肺鳞癌诊治及预后判断标志物奠定基础。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    实验组来自2002-2004年贵阳医学院附属手术切除的肺鳞癌标本25例,男17例,女8例。年龄46～75岁。所有病例术前均未行放、化疗。按照世界卫生组织(WHO)肺及胸膜肿瘤组织学分类，25例均为鳞癌。组织学分级(只限于鳞癌)：Ⅰ级5例,Ⅱ级9例, Ⅲ级11例。有淋巴结转移者18例,无淋巴结转移者7例。对照组18例,包括11例手术切除炎性假瘤病例的肺组织和3例尸检的肺组织,以及4例肺大疱的肺组织。所有标本均经10%中性甲醛固定,常规石蜡包埋。

    1. 2  实验方法　

    1. 2.1  标本处理  取手术切除的肿瘤组织和排除肺肿瘤以外的肺组织标本各1.5 cm×1.5 cm×0.2 cm，所有标本均以10%中性甲醛固定, 常规石蜡包埋。

    1.2.2  组织微阵列的制作  对每一个标本蜡块进行常规病理切片并行HE 染色，由病理科专家在显微镜下标记所需穿取的目的组织。利用美国Beecher组织微阵列仪(Beecher Instruments  Inc)依次从受体蜡块上穿取直径为1.0 mm的组织芯头，然后在供体蜡块上根据所标记的位置准确取出所要的组织芯放入受体蜡块的孔中，制作组织微阵列标本蜡块。详细记录每个孔所放组织的编号，每个肺鳞癌和正常组织蜡块分别选取3个点，制成阵列蜡块，然后用切片机将此蜡块作3 μm厚的切片，粘贴于1张由多聚赖氨酸处理过的载玻片上，制成组织芯片，60 ℃ 烤5 h,置于-20 ℃ 冰箱中保存备用。

    1.2.3  检测方法  利用免疫组织化学SABC法观察HMGA1表达。HMGA1多克隆抗体购于美国Abcam公司，工作浓度为1∶50，SABC 试剂盒及DAB显色液均为武汉博士德公司产品，按说明书步骤进行。切片常规化蜡下行至水,3%H2O2封闭内源性过氧化物酶10 min,微波修复，5%BSA封闭液封闭,滴加一抗置于4 ℃冰箱湿盒过夜。次日取出切片，依次加入生物素标记的二抗和过氧化物酶标记的链酶亲和素-生物素-酶复合物（Strept-Avidin-Biotin Complex，SABC），置于37 ℃水浴箱各孵育20 min，DAB显色，苏木素复染,上行，封片观察。

    1.3  评定标准

    显微镜下对每一个微阵列点进行观察并评分。每个组织取3个点，计数每个点总细胞数和阳性细胞的平均数，阳性细胞率<5%为阴性，阳性细胞率>5%为阳性。HMGA1表达阳性表现为在细胞浆和(或)细胞核内着棕黄色。

    1.4  统计方法

    采用SPSS11.5统计软件行χ2检验，临床病理参数间的比较用Fisher确切概率法检验，P<0.05时有统计学意义。

    2  结果

    2.1  组织芯片构建图

    由图1和图2可见，以免疫组织化学SABC法染色后基本无掉片、移位和扭曲现象,有个别点脱落,但不影响结果的观察。

    2.2  HMGA1蛋白在肺鳞癌和对照组肺组织中的表达结果

    HMGA1蛋白表达呈棕黄色颗粒，见图3，箭头所指处来源于图2实验组织芯片的一部分，主要于肺鳞癌细胞胞质,极少数在胞核表达。表1可见, HMGA1蛋白在肺鳞癌和对照组肺组织中的阳性表达率分别为68.00% ( 17 /25)、16.67(3/18)，两组之间差异具有显著性(P<0.05) 。表1  HMGA1蛋白在肺鳞状细胞癌及对照组中的表达比较

    2.3  HMGA1蛋白表达与肺鳞癌临床病理参数之间的关系

    由表2可见，HMGA1蛋白表达与肺鳞癌的淋巴结转移、分化程度有关（P<0.05）：肺鳞癌患者有淋巴结转移的阳性率为83.3%,无淋巴结转移的阳性率为28.6%,两者之间的差异具有显著性;高-中分化的肺鳞癌组织阳性率为50.0% ,低分化阳性率为90.9% ,两者之间差异具有显著性，HMGA1蛋白阳性率随着分化程度的降低而表达增强(P<0.05) 。表2  肺鳞癌患者HMGA1蛋白的表达与临床病理参数的关系

    3  讨论

    HMGA1是Goodwin 等［2］于1973 年在牛胸腺细胞中首次发现的，因其在聚丙烯酰胺凝胶中的高迁移率而得名的一组蛋白。HMGA1有1a和1b 2种蛋白质亚型，二者均属于小分子染色体非组蛋白，都是由HMGA1 mRNA分子转录后经不同剪接而来。不同的是，在1a亚型内部存在11个氨基酸残基。HMGA1广泛参与细胞多种重要的核内生物学功能。在正常情况中，HMGA1在胚胎组织中高表达，在成熟组织和细胞中则不表达或表达量极低。有研究表明，HMGA1在许多人类肿瘤都高度表达［3］。在肝细胞癌及甲状腺、前列腺、子宫颈、结肠直肠、胰腺和卵巢等肿瘤中，HMGA1的含量都显著增加［4］。我们前期应用基因芯片技术对肺鳞癌基因表达的研究也显示HMGA1基因表达显著增加。为了验证基因芯片的研究结果，采用具有高通量、节约试剂、降低实验误差的组织芯片技术，对对照组肺组织及肺鳞癌组织中HMGA1蛋白表达进行免疫组织化学研究，以探讨HMGA1在肺鳞癌发生、中可能的生物学意义。结果发现，肺鳞癌组织中HMGA1蛋白的表达阳性率显著高于正常对照组，且与肺鳞癌病人淋巴结转移及分化程度有关，与病人性别及年龄无关。提示HMGA1蛋白可能是肺鳞癌分化及恶性程度的一个进展性指标。

    　　有人用定量RT-PCR的研究方法表明，与对照组的肺组织相比，肺癌组织内的HMGA1a mRNA增加超过75% [5］ 。本实验研究显示HMGA1在正常肺组织中呈低表达, 阳性率仅为16.7 %，而在肺鳞癌组织中表达明显增高, 阳性率高达68.0%,提示检测HMGA1的表达有助于肺鳞癌诊断。另外，研究结果显示，HMGA1蛋白的表达与淋巴结是否转移和分化程度密切相关(P<0.05) ,分化程度越低,其表达越高,有淋巴结转移的组织阳性率要比无淋巴转移的要高，这就可以解释为什么分化越低，有淋巴结转移的肿瘤增殖越快。以上结果均与单纯用免疫组织化学方法做得的结果一致，提示检测肺鳞癌中HMGA1蛋白的表达对临床的预后判断和个体化也都具有一定的指导意义。

【】
  [1] Edberg DD, Bruce JE, Siems WF, et al. In vivo posttranslational modifications of the high mobi-lity group A1a proteins in breast cancer cells of differing metastatic potential[J]. Biochemistry, 2004(36): 11500-11515.

[2] Goodwin GH, Sanders C, Johns EW. A new group of chromatin-associated proteins with a high content of acidic and basic amino acids[J]. Eur J Biochem,1973(1): 14-19.

[3] Edberg DD. In vivo posttranslational modifications of the high mobility group A1a proteins in breast cancer cells of differing metastatic potential[J].Biochemistry,2004(36): 11500-11515.

[4] Melvin VS.The C-terminal Extension (CTE) of the Nuclear Hormone Receptor DNA Binding Domain Determines Interactions and Functional Response to the HMGB-1/-2 Co-regulatory[J].Protein J Biol Chem, 2002（277）: 25115-25124.

[5] Bhattacharya R. Mukherjee M, Resar LMS. The role of HMGA1 in the pathogenesis of human lung cancer[J].Proc Amer Assoc Cancer Res, 2005（46） :879-880.