MK2不同突变体的构建、表达及细胞内定位的研究
作者：魏洁 龚小卫 明小燕 王旭 王达安 邓 鹏 姜勇
【摘要】 目的： 为了研究MAPK激活蛋白激酶2 (MAPK-activated protein kinase 2, MK2)细胞内定位与其功能的关系，构建了MK2不同突变体的绿色荧光蛋白融合表达载体并观察这些突变体在细胞内的定位情况。 方法： 将克隆在绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2上的野生型MK2(WT)通过定点突变技术构建其无活性突变体MK2(320A)和活性突变体MK2(320E)，转染NIH3T3细胞，并在荧光显微镜下观察其细胞内定位情况。结果： 各种MK2不同突变体经测序鉴定正确后，在NIH3T3细胞中得到高量表达。融合蛋白发出的绿色荧光表明，在静息状态下，MK2(WT)主要分布于细胞核内，MK2(320E)主要分布于细胞质内，而MK2(320A)在细胞核和细胞质中都有分布。在受到紫外线（UV）刺激后，MK2(WT)和MK2(320A)移位出核，而MK2(320E)的细胞内定位则没有发生明显的改变。结论： 成功构建了绿色荧光蛋白标记的MK2不同突变体并在真核细胞中进行了表达，观察到不同突变体对MK2细胞内定位的影响。
【关键词】 蛋白激酶类； 突变； 基因表达； 细胞内定位； p38丝裂原活化蛋白激酶； MAPK激活蛋白激酶2
［Abstract］ Objective: To study the intracellular localization of MAPK-activated protein kinase 2 (MAPKAPK2/MK2) and its relation with the function. Methods: Eukaryotic cell expression vectors of green fluorescent protein fused with MAPK-activated protein kinase 2 (MK2) mutants were constructed. Wild-type MK2 cloned in the green fluorescent protein vector, pEGFP-C2, was site-mutated to produce dominant negative mutant MK2(320A) and constitutively active mutant MK2(320E). Then the mutants were transfected into NIH3T3 cells, and the intracellular localizations of these mutants were observed with fluorescence microscope. Results: After identification by sequencing, the GFP-fused MK2 mutants were highly expressed in NIH3T3 cells. The green fluorescence of fusion proteins showed that in resting cells, MK2(WT) were mainly in the nuclei, and MK2 (320E) was mainly in the cytosol, while MK2(320A) dispersed all over the cell. Once the cells were stimulated by UV, MK2 (WT) translocated into the cytosol, while the intracellular localizations of MK2 (320E) showed no stress-dependent redistribution. Conclusions: Expression vectors with different mutants of MK2 fused with GFP are successfully constructed and highly expressed in eukaryotic cells. Some functional point mutations have effects on the intracellular localizations of MK2.
［Key words］ protein kinases; mutation; gene expression; intracellular localization; p38 mitogen activated protein kinase; MAPK-activated protein kinase 2
p38 丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）通路参与细胞生长、发育、分裂及细胞间功能同步等多种细胞生理过程的调控。在紫外线（ultraviolet, UV）照射、高渗、细菌脂多糖（lipopolysacharides, LPS）及炎性因子等作用下，p38 MAPK被磷酸化激活［1］。活化的p38可通过磷酸化许多不同的底物，来介导诸如炎症因子的产生和细胞骨架重调等多种细胞反应［2］。MAPK激活蛋白激酶2（MAPK-activated protein kinase 2, MAPKAPK2 or MK2）作为p38的重要底物，具有多种细胞功能，例如稳定富含AU元件的mRNA、调节肌动蛋白重建、调控细胞周期、参与细胞迁移等［3,4］。MK2被p38磷酸化激活后移位至胞浆，通过磷酸化小分子量热休克蛋白（small heat shock protein, sHSP）HSP27，来介导细胞骨架重调［5］。但目前对MK2的细胞内定位与其功能的关系还存在疑问。为了进一步阐明MK2细胞内定位与功能之间的关系，构建了绿色荧光蛋白（green fluorescence protein, GFP）标记的MK2不同突变体的融合表达载体，在哺乳动物细胞中进行表达并观察这些突变体在细胞内的定位情况。
1 材料和方法
1.1 质粒、菌株和试剂
绿色荧光蛋白标记的小鼠MK2融合表达载体GFP-MK2由美国Scripps研究所韩家淮教授馈赠。将该质粒转化大肠杆菌株DH5α，提取质粒DNA，用DNA定量仪测定浓度后置-20 ℃保存。大肠杆菌株DH5α和小鼠NIH3T3细胞系由本室保存。DNA ladder和MutanBEST定点突变试剂盒购自TaKaRa公司；引物合成和测序分析由Invitrogen公司完成。Petri小皿和细胞培养皿购自Corning公司。DMEM培养基、Opti-MEM培养基和胎牛血清（FBS）是Gibco BRL公司产品。4, 6-联脒-2-苯基吲哚（4′, 6-Diamidino-2-phenylindole, DAPI）购自Sigma-Aldrich公司。PolyFect脂质体转染试剂和质粒小量制备试剂盒购自QIAGEN公司。
1.2 细胞培养
NIH3T3细胞用含5% FBS的DMEM培养基在CO2培养箱（37 ℃、5% CO2）中培养。
1.3 GFP融合的MK2不同突变体的构建
利用MutanBEST定点突变试剂盒对GFP标记的小鼠MK2进行不同突变（图1）。突变所用的引物序列分别为：MK2(320A)的上游引物为5’- GCA CCA CTG CAC ACC AGC CGT GTC CTG AA -3’, 下游引物为5’- CTG AGG GAC CTT CGT AGA TTG CAT GA -3’；MK2(320E)的上游引物为5’- GAA CCA CTG CAC ACC AGC CGT GTC CTG AA -3’, 下游引物与MK2(320A)的下游引物相同。上述引物中，相对应的上游引物与下游引物5’端邻接，3’端方向相反。用Pyrobest高保真聚合酶进行PCR反应（95 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 5 min，共35个循环），扩增片段大小为5.9 kb左右。将PCR产物电泳切胶回收，再根据MutanBEST定点突变试剂盒的使用说明将PCR回收产物进行末端平滑、5’磷酸化，然后用酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）溶液进行抽提，乙醇沉淀。用10 μl ddH2O溶解DNA后，取5 μl DNA与等量solution I进行连接反应（16 ℃，1 h），最后将全量连接产物转化大肠杆菌DH5α，铺在含卡那霉素（Kan+）的LB培养板上。得到的克隆各随机挑取3个菌落接种于LB培养基（Kan+）中，37 ℃振摇过夜。取5 ml菌液用QIAprep Spin Miniprep Kit小量提取质粒后，进行测序分析。
1.4 PolyFect介导的瞬时转染
在Petri细胞培养皿中按2×104个/皿铺入NIH3T3细胞。24 h后，利用PolyFect对 GFP标记的MK2野生型及不同突变体的重组质粒进行瞬时转染。将0.4 μg DNA用25 μl无血清、无抗生素的Opti-MEM培养基稀释并混匀，取2 μl PolyFect脂质体加入DNA中，再次混匀并在室温下孵育10 min。DNA-PolyFect混合物加入100 μl含FBS的DMEM培养基（FBS终浓度为5%），轻轻混匀。弃去Petri皿中原来的培养基，将含有DNA-PolyFect混合物的DMEM培养基加入细胞，置于CO2培养箱（37 ℃、5%CO2）中孵育24 h。
1.5 荧光显微镜下观察
紫外线照射利用日本Lutron Electronic公司的YK-34UV型紫外辐照仪进行定量。转染细胞用40 J/m2 中波紫外线（UVB）不刺激或刺激1 h后，PBS洗涤1次，用4%多聚甲醛固定10 min。PBS洗涤3次，用500 μg/L DAPI染核并封片，分别利用Leica荧光显微镜的A4和L5滤光片进行观察和图像采集。
2 结果
2.1 GFP标记的MK2不同突变体的测序鉴定
为了鉴定各突变体是否突变成功，将小量提取的重组质粒进行序列分析。测序结果证实，各不同突变反应都成功得到了相应的突变体（图2）。
2.2 GFP标记的MK2不同突变体在NIH3T3细胞中的表达和定位
为了证实各测序正确的不同突变体能在真核细胞中进行表达，GFP标记的MK2不同突变体融注：A：MK2（320A）；B：MK2（320E）合表达载体在NIH3T3细胞中进行了转染。在荧光显微镜下观察发现，GFP标记的MK2不同突变体表达的融合蛋白都能发出明亮的绿色荧光（图3）。进一步对MK2不同突变体在细胞内的定位情况进行了研究,结果表明，在静息状态下，从荧光分布可以看出，MK2(WT)主要分布于细胞核内，MK2(320E)主要分布于细胞质内，而MK2(320A)在细胞核和细胞质中都有分布。在受到UV刺激后，MK2(WT)和MK2(320A)移位出核，而MK2(320E)的细胞内定位则没有发生明显的改变（图3）。该实验重复了3次，结果一致。
3 讨论
MK2是于1992年发现并被纯化的第一个MAPK激活蛋白激酶，能够被p38磷酸化和激活［6］。MK2不仅是p38的底物，而且可与p38形成复合物从而起到稳定p38的作用，但具体机制还不清楚。p38在胞浆内的状态要比在胞核内更稳定，其复合物形式要比单体形式更稳定［7］。MK2有多种下游底物，不同底物使其具有多种生物学功能。MK2的重要功能有稳定并调控富含AU 元件的mRNA、调节肌动蛋白的重建等。MK2富含脯氨酸的区域可以将MK2锚定于肌动蛋白上，从而磷酸化HSP27，使其与微丝解离，这可能是肌动蛋白聚合的机制之一。有研究表明，在LPS介导的TNF的生物合成中需要MK2催化活性的参与。具有激酶活性的MK2对p38稳定及转运后更能促进TNF的合成。MK2的C末端具有一个核输出信号（nuclear export signal, NES）和一个核定位信号（nuclear localization signal, NLS），这两者的存在使MK2可于胞核与胞浆之间进行穿梭［7~9］。其NLS、NES通过对MK2细胞定位的影响而影响TNF的生物合成［3,7］。可以看出，MK2的生物学功能与其细胞内定位有着密切的联系，它可以通过不同的定位影响其上、下游激酶，进而发挥多种作用。
为了进一步阐明MK2的细胞内定位与功能之间的关系，构建了GFP标记的MK2不同突变体的融合表达载体，在真核细胞中进行了表达并观察这些突变体在细胞内的定位情况。结果显示，静息状态下的MK2（WT）主要分布于细胞核内，MK2(320E)主要分布于细胞质内，而MK2(320A)在细胞核和细胞质中都有分布。在受到UV刺激后，MK2(WT)和MK2(320A)移位出核，而MK2(320E)的细胞内定位则没有发生明显的改变。上述结果说明，MK2的磷酸化位点能够影响其细胞内定位。Haar等［10］的研究表明，MK2在受到p38调控的同时也影响着p38的定位。在p38 MAPK信号通路中，MK2介导了p38-MK2-Akt-Hsp27复合物的形成，此复合物参与调节了应激诱导的凋亡和细胞骨架重组［11,12］。说明MK2的定位不仅与自身的功能有关，而且影响着p38 MAPK通路中信号分子的定位与功能。
在本研究中，通过构建MK2不同突变体的GFP融合蛋白表达载体，并观察其在真核细胞内的定位，不但为更深一步研究MK2的定位与功能之间的关系奠定了坚实的基础，也为阐明MK2在某些p38 MAPK信号通路异常相关疾病的发生机理和提供了工具。
【】
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