碘化钾对实验性铅性肾病的保护作用及其对转化生长因子?β表达的影响

                作者：乔玉峰，庞东梓，李荣山，蒋云生

【摘要】  目的：观察碘化钾对铅性肾病的保护作用，并从蛋白质和分子水平观察其对转化生长因子?β(TGF?β)表达的影响。方法：SD大鼠48只(180～220 g)适应性饲养1周，随机分为两组，每组根据时间点的不同又分3个亚组。APb，BPb，CPb为染铅组，分别给予0.5%的醋酸铅喂饮1，2，3个月;AKI，BKI，CKI为碘化钾组，给予0.5%醋酸铅喂饮的同时予碘化钾(3 mg/100 g体重)，用注射用水稀释灌胃每日1次，时间分别为1，2，3个月，所有实验组中大鼠每天的饮水量大致相同。实验结束时称体重、肾重;原子吸收光谱石墨炉法测量血铅、肾铅含量;用免疫组织化学的方法检测肾组织TGF?β蛋白的表达，用RT?PCR的方法检测肾组织TGF?β mRNA的表达。结果：实验到第3个月时，碘化钾组与染铅组比较体重差显著增高，肾重/体重比显著降低;血铅、肾铅含量显著降低;而实验前2个月无明显差别。肾组织TGF?β蛋白和mRNA的表达在两组中差异无显著性。结论：碘化钾能拮抗铅对大鼠生长发育的影响，并有驱铅的作用，但对TGF?β的影响不大。

【关键词】  碘化钾;铅性肾病;转化生长因子?β

　　Abstract Objective：To investigate the protective effect of potassium iodide on experimental lead nephropathy，and its influence on the expression of transforming growth factor?βin kidney at molecular.Methods：Forty?eight SD rats weigh 180～220 g were randomly assigned into two groups.The rats in Pb groups were given 0.5% lead acetate water for 1，2，3 months respectively(APb，BPb，CPb)，while the rats in KI groups were given 0.5% lead acetate water simultaneously taking potassium iodide 3 mg/100 g body weight by intragastric administration for 1，2，3 months respectively(AKI，BKI，CKI).All rats were sacrificed at the end of the treatment.The body and renal weigh were measured.Lead concentrations in blood and kidney were determined by atomic absorption photometry with non?flame graphite oven.Expression of TGF?βprotein and mRNA in kidney was measured by immunohistochemistry and RT?PCR respectively.Results：The weight gain in CKI group was significantly increased as compared with CPb group，while the ratio of kidney weight/body weight.Blood and renal lead concentrations were significantly decreased as compared with CPb group.The expression of TGF?βprotein and mRNA in all groups had no significant difference.Conclusion：Potassium iodide could antagonize the lead?induced reduction in growth and lustrate lead，while it has no effect on TGF?βexpression in this study.

　　Key words potassium iodide;lead nephropathy;transforming growth factor?β

　　对铅性损害的防治，我国仍处于发现铅中毒则驱铅的被动状态。虽然环境治理能减少铅中毒的发生率，但铅在体内的半衰期长达10年，累积性中毒不可避免，因而本领域的分为环境治理和药物预防，而药物的选择应该是从细胞分子水平研究其机制及疗效[1]。本文在原有碘化钾器官驱铅基础上[2～4]，从蛋白质和分子水平观察其对转化生长因子?β(TGF?β)表达的影响，希望为防治铅性肾病的方法提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂与材料

　　体重180～220 g的健康雄性Sprague?Dawlay大鼠72只，购自山西医科大学动物实验中心，清洁级;醋酸铅分析纯，上海试剂三厂;TGF?β免疫组织化学试剂盒，武汉博士德公司;逆转录试剂盒及聚合酶链反应试剂盒，上海Sangon公司;TGF?β及GAPDH引物序列及目的基因见表1，上海Sangon公司合成。表1 TGF?β及GAPDH引物序列

　　引物名称上游序列下游序列〖〗产物长度bpTGF?β5′?atacgcctgagtggctgtct?3′5′?tgggactgatcccattgatt?3′153GAPDH5′?taaagggcatcctgggctacact?3′5′?ttactccttggaggccatgtagg?3′199

　　1.2 实验动物及分组

　　SD大鼠48只适应性饲养1周，采用随机原则将动物分为2组。染铅组(3个亚组)：分别观察1个月(APb组)，2个月(BPb组)，3个月(CPb组)，给予0.5%醋酸铅自由饮用;碘化钾组(3个亚组)：给予0.5%醋酸铅自由饮用，同时予碘化钾(3 mg/100 g体重)用注射用水稀释，每日1次灌胃，分别观察1个月(AKI组)，2个月(BKI组)，3个月(CKI组)。实验结束动物称重，戊巴比妥钠(60 mg/kg)腹腔注射麻醉，体积分数为75%乙醇消毒，心脏采血，无菌取肾，称重。左肾立即取小块组织作电镜标本后用体积分数为10%甲醇溶液固定，制备石蜡切片，右肾组织置于液氮备用。

　　1.3 大鼠体重差及肾重/体重比的检测

　　实验结束时所得大鼠体重与实验开始时大鼠体重的差，反映大鼠在实验过程中体重的增长情况，将此差值进行统计学分析以了解大鼠的生长情况。将实验结束时称得的两肾重量与实验结束时体重的比值进行统计学分析，反映肾脏的相对重量。

　　1.4 大鼠血铅及肾铅的检测

　　实验结束时，心脏采血后制得血浆，用原子吸收光谱石墨炉法测定血铅的含量。将肾组织热消化后按铅测定的条件用日立180?70型原子吸收分光光度计测定铅含量[1]。

　　1.5 TGF?β蛋白表达的检测

　　用免疫组化的方法，采用即用型二步法，阳性组织呈棕色，而阴性部分呈蓝色。结果的半定量分析采用北航图像采集模块软件，每张切片随机采集20个视野(10×物镜)，随后利用北航医学病理图像分析软件对每个视野进行分析，其阳性染色面积/视野总面积的大小即反映免疫组化阳性目标的强度，亦即反映了抗原(TGF?β)的数量。

　　1.6 TGF?β mRNA表达的检测

　　肾皮质组织50～100 mg按Trizol说明书提取总RNA，核酸蛋白测定仪检测其浓度及纯度。选纯度在1.6～2.0之间的标本，将其总RNA 4 μg经70℃ 5 min，37℃ 65 min，70℃ 10 min逆转录为cD?NA。以此为模板用TGF?β引物进行PCR扩增，50 μL PCR反应体积中含RNase?free水16 μL，2×HiFi?PCR master 25 μL，12.5 μmol/L的待检基因上下游引物各2 μL，稀释成400 μL的模板cDNA 5 μL。扩增条件：TGF?β为94℃2 min预变性，94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 40 s，共40个循环，最后72℃ 7 min延伸;GAPDH为94℃ 2 min预变性，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共40个循环，最后72℃ 7 min延伸。2.0%(W/V)琼脂糖凝胶1～5 V/cm电压电泳，紫外检测仪观察拍照。并在Smart View2000图像处理系统中进行灰度扫描，上述基因的相对表达量。目的基因mRNA表达量=每例标本目的基因的平均灰度值/同一标本GAPDH的平均灰度值。

　　1.7 统计学方法

　　所有数据均以±s表示，SPSS 13.0软件进行统计学处理，多组间均数的比较使用方差齐性检验及方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 大鼠体重差、肾重/体重比的结果(见表2)

　　如表2所示，碘化钾组体重差与染铅组比较1个月，2个月组差异无显著性，3个月组显著增高，差异有统计学意义(P<0.05)。而碘化钾治疗组肾重/体重比与染铅组比较1，2个月组差异无显著性，3个月组显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

　　2.2 各组大鼠血铅及肾铅含量的结果(见表3)

　　如表3所示，血铅、肾铅含量在APb和BPb组与AKI和BKI组中比较，差异无统计学意义，而CKI组血铅、肾铅含量明显低于CPb组(P<0.05)。表2 各组不同处理时间大鼠体重差、肾重/体重比 表3 各组不同处理时间大鼠血铅与肾脏铅含量

　　2.3 肾组织TGF?β蛋白的表达(见表4，图1)

　　肾组织中TGF?β蛋白的表达主要分布于肾小管，肾小球未见明显阳性染色。碘化钾组与其相应的染铅组相比，肾组织TGF?β蛋白的表达无明显的变化，差异无统计学意义。表4 各组不同处理时间大鼠肾组织TGF?β蛋白表达(阳性染色面积/视野总面积)

　　图1 各组不同处理时间大鼠肾组织TGF?β蛋白表达

　　2.4 肾组织中TGF?β mRNA的表达(见表5)

　　如表5所示，碘化钾组与染铅组相比，肾组织TGF?β mRNA的表达在碘化钾组与染铅组中均无明显差异。表5 各组不同处理时间大鼠肾组织TGF?β mRNA的表

　　3 讨 论

　　许多研究证实，碘化钾具有驱铅和抗铅性肾损害的作用，口服碘化钾有排铅、降低尿糖和尿蛋白、改善肾功能、提高肾小球滤过率、降低血铅及肾组织铅、减轻肾间质纤维化的作用，但是对分子水平的作用机制尚未见报道，特别是与肾纤维化相关因子的关系如何尚不清楚[2～4]。

　　本实验采用在大鼠染铅的同时给予碘化钾的预防性模型设计方案，就其预防作用和机制进行了初步研究。结果发现各组的生长发育在前2个月的实验过程中没有显著差异，染铅3个月组的体重显著低于碘化钾组。肾脏重量与体重的比值反映了肾脏的相对重量，也反映了肾脏受损的程度[5]。碘化钾治疗后显示相同的效果。这些均表明碘化钾的良好的预防和治疗作用不仅能抗组织细胞损害，同时能纠正铅对机体代谢及生长发育的不良影响。

　　血铅含量是最直接反映铅中毒的指标之一，血铅含量为60 μg/dL是人和动物铅暴露是否对肾脏损伤的临界指标[6，7]。肾脏是铅进行代谢的主要器官，进入机体的铅99%从肾脏代谢，因此，肾脏也是铅中毒的主要受损器官[5，8]。本组结果显示，染铅3个月后，碘化钾组血铅、肾铅含量较染铅组显著降低。这也进一步证实了碘化钾的驱铅作用，可在很大程度上减少铅在肾脏的蓄积，这与以往的报道是相吻合的[2]。

　　转化生长因子?β(TGF?β)是目前发现的最强的促肾脏纤维化因子的影响[9]。实验发现，3组碘化钾组中TGF?β的蛋白及mRNA的表达与染铅组相比差异无任何差别。之前的研究显示，铅对TGF?β表达的影响为迟发性的间接的影响[10]。推测碘化钾可能也存在保护作用机制上的迟发性影响，由于本实验只做了3个月的时间，不能完整观察更长时间碘化钾对该因子的作用，不能定论。我们将在以后的研究中进一步探索碘化钾对该因子的作用。

　　总之，碘化钾能拮抗铅对大鼠生长发育的影响，并有驱铅作用。但其作用机制似乎与TGF?β无关抑或存在作用上的迟发性。

【文献】
  　[1]Brewster U C，Perazella N A.A review of chronic lead intoxication：an unrecognized cause of chronic kidney disease[J].Am J Med Sci，2004，327(6)：341?347.〖1〗[2]蒋云生，夏运成，徐锡萍.碘化钾和硫胺素抗铅性肾损害效果观察[J].中华预防医学杂志，1997，31(4)：252?253.〖1〗[3]蒋云生，夏运成，罗季安，等.碘化钾抗铅性肾细胞损害的机制探讨[J].中华劳动卫生职业病杂志，1997，15(3)：169?170.〖1〗[4]蒋云生，胡益群，王秀良，等.不同剂量碘化钾缓释片和胶囊的驱铅作用比较[J].新药与临床杂志，2001，20(6)：481?483.〖1〗[5]Wedeen R P，Maesaka J K，Weiner B，et al.Occupational lead nephtopath[J].Am J Med，1975，59(5)：630?641.〖1〗[6]Gidlow D A.Lead toxicity[J].Occupational Medicine，2004，54(2)：76?81.〖1〗[7]Yu C C，Lin J L，Lin?Tan D T.Environmental exposure to lead and progression of chronic renal diseases：a four?year prospective longitudinal study[J].J Am Soc Nephrol，2004，15(4)：1 016?1 022.〖1〗[8]黄瑞雪.铅性肾病动物模型的建立[J].动物医学进展，2004，25(1)：88?90.〖1〗[9]Nawshad A，LaGamba D，Hay E D.Transforming growth factor beta(TGF beta)signalling in palatal growth，apoptosis and epithelial mesenchymal transformation(EMT)[J].Arch Oral Biol，2004，49(9)：675?689.〖1〗[10]乔玉峰，蒋云生，庞东梓.染铅大鼠肾脏纤维化相关基因的表达[J].中华劳动卫生职业病杂志，2006，3：139?142.