蛋白酶体抑制剂硼替佐米联合柔红霉素对HL?60细胞的凋亡作用和Survivin mRNA表达的影响

【摘要】  目的：研究蛋白酶体抑制剂硼替佐米(Bor)单用或联合柔红霉素(DNR)对HL?60细胞凋亡和Survivin mRNA表达的影响。方法：将不同浓度Bor，DNR及两药联合组和对照组作用于HL?60细胞，采用MTT法测定细胞增殖活性，RT?PCR检测Survivin mRNA表达。结果：5 nmol/L Bor作用24 h对HL?60细胞有增殖抑制作用，并诱导其凋亡。随着浓度增加及其作用时间的延长可使细胞凋亡率明显增加，10 nmol/L Bor与1.0 μmol/L DNR联合作用72 h细胞凋亡率最高，与同剂量两药单独作用相比差异有显著性(P＜0.01)。RT?PCR检测结果表明：随着药物浓度的增加，Survivin mRNA的表达逐渐下降，10 mmol/L Bor与1.0 μmol/L DNR联合作用72 h Survivin mRNA表达最低。结论：Bor能显著抑制HL?60细胞的增殖并诱导其凋亡，Bor联合DNR对HL?60细胞有协同作用，并能显著下调Survivin基因的表达，这可能是促使HL?60细胞凋亡的机制之一。

【关键词】  蛋白酶体抑制剂 硼替佐米 柔红霉素 HL?60细胞

    Abstract  Objective：To investigate the effect of proteasome inhibitor bortezomib(Bor) alone and combination with daunomycin(DNR) on apoptosis of HL?60 cells and the expression of Survivin mRNA.Methods：HL?60 cells were treated with Bor，DNR in different concentration for 24～72 h.Cell proliferation was analyzed by MTT assay，the expression of survivin mRNA was analyzed by RT?PCR.Results：5 nmol/L Bor could effectively inhibit HL?60 cell proliferation and induced its apoptosis after 24 h.HL?60 cell apoptosis rate significantly increased with time prolongation or does increase.The highest apoptosis rate resulted in 10 nmol/L Bor combination with 1.0 μmol/L DNR after 72 h，the expression of survivin mRNA decreased with the agents concentration increasing.Conclusion：Bor can signifi? cantly inhibit the proliferation of HL?60 cells and induce apoptosis，synergistic effectiveness and dow?regulated expression of survivin mRNA can be found when Bor combination with DNR，which might be associated with mechanism of HL?60 cells apoptosis.

    Key words  proteasome inhibitor；bortezomib；daunomycin；HL?60 cells

    急性早幼粒细胞白血病(APL)是一种特殊类型的白血病，硼替佐米(Bor)是一种新型的肿瘤靶向药物。Carter等［1］用RT?PCR方法检测18 例急性单核细胞白血病(AML)患者的Survivin基因，发现16 例患者表现为不同程度的Survivin阳性。Adida等［2］同样发现在急性单核细胞白血病(AML)中Survivin基因高表达的情况。这为进一步揭示Survivin与白血病的关系奠定了基础。本实验用合适浓度Bor、柔红霉素(DNR)及两药联合处理HL?60细胞，采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞凋亡，RT?PCR方法检测Survivin基因的表达，旨在为临床应用Bor联合DNR提供理论依据。

    1  资料与方法

    1.1  试剂与仪器

    RPMI 1640培养液购自Gibco公司，新生胎牛血清为杭州四季青公司产品，β?actin和Survivin引物由上海生物工程公司合成。TRIzol试剂、TaqDNA聚合酶、Rnasin、AMV为Fermentas公司产品。MTT为Sigma公司产品，人急性髓细胞白血病细胞株HL?60山西医科大学实验中心保存。Bor为美国Millennium公司产品，用无菌注射用水配成1 mg/10 mL，备用。PNR为浙江海正公司产品，用三蒸水配成10 mg/mL，使用时稀释至所需浓度。

    1.2  细胞培养

    HL?60细胞用含10％胎牛血清RPMI1640培养液，在37℃，5％CO2条件下培养，2～3 d换液1次，取对数生长期细胞用于实验。

    1.3  研究方案

    本实验依预实验结果，选择DNR 0.5 μmol/L(A1组)、1.0 μmol/L(A2组)、Bor 5 nmol/L(B1组)、10 nmol/L(B2组)及DNA 0.5 μmol/L＋Bor 5 nmol/L为E组，DNR 0.5 μmol/L＋Bor 10 nmol/L为F组，DNR 0.1 nmol/L＋Bor 5 nmol/L为G组，DNR 0.1 μmol/L＋Bor 10 μmol/L为H组，处理24，48，72 h，观察药物时间反应，选择药物作用最强的时间段进行Survivin基因检测，以观察两药联合效应。

    1.4  细胞增殖活性MTT检测

    对数生长期细胞调整密度为1×105/mL，每孔100 μL接种，分别加入不同浓度的药物，终体积为200 μL，每浓度设3个复孔，培养至相应时间后，加入20 μL MTT(5 mg/mL)，继续孵育4 h，离心并吸弃上清液，加DMSO(二甲基亚砜)，每孔170 μL，轻震荡，酶标仪测570 nmOD值(A)。细胞活力：细胞活力(％)＝(A处理组－A凋零组)/(A对照组－A凋零组)×100％。

    1.5  逆转录聚合酶链反应(RT?PCR)

    收集培养的72 h各药物处理细胞用TRIzol提取RNA。cDNA的合成按Fermentas试剂公司说明书操作。总反应体系为5 μL，其中包括水27 μL，10×buffer 5 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，Survivin，β?actin引物各0.5 μL，Tap酶2 μL，25 mmol/L，MgCl2 4 μL，cDNA 10 μL，Survivin和β?actin的扩增条件见表1。表1  Survivin和β?actin基因在RTPCR中的圹增条件

    1.6  PCR产物产品量分析

    Survivin及β?actin扩增产物，将Survivin平均灰度值除以β?actin的平均灰度值表示进行定量。

    1.7  统计学方法

    所有实验至少重复3次，采用10.0统计软件分析，多重两两比较采用方差分析LSD法，Survivin基因检测应用析因设计的方差分析，P＜0.05为差异有显著性。

    2  结    果

    2.1  HL?60细胞的增殖活性

    各浓度药物作用24 h均可见对HL?60细胞的抑制作用，随浓度增加和时间延长抑制效果逐渐增强在每一药物浓度的时间段相比有统计学意义(P＜0.01)，(见图1)。Bor组和DNR组各浓度之间作用相比有统计学意义(P＜0.01)。5 nmol Bor作用24 h出现细胞凋亡，作用48 h，72 h细胞凋亡增加。10 nmol Bor与1.0 μmol DNR联合作用后增殖活力为34.02％，29.51％，18.40％，较两药单独作用的抑制作用显著增强(P＜0.01)(见图2)。

    2.2  RT?PCR检测Survivin mRNA

    各浓度药物处理细胞72 h，均可见Survivin mRNA的表达下降。与对照组相比差异有显著性(P＜0.01)。Bor组和DNR组各浓度之间随着浓度的增加Survivin基因表达下降，联合组各浓度之间存在着差异，高浓度联合较低浓度联合相比有统计学意义(P＜0.01)，高浓度联合组Survivin基因表达明显较低浓度组表达低，两药单独作用与联合组之间存在交互作用，且以1.0 μmol DNR联合10 nmol Bor作用72 h Survivin mRNA的表达量最低。

    3  讨    论

    Bor是一种新型抗肿瘤靶向药物，主要通过抑制真核生物26S蛋白酶体对蛋白质降解，促使多种与细胞增殖、分化、存活、凋亡密切相关的蛋白代谢发生紊乱，诱导细胞凋亡［3］。目前，第一个批准应用于临床的蛋白酶体抑制剂类药物Bor对复发难治的多发性骨髓瘤患者已显示出良好的疗效，对白血病的疗效也正在评价之中。Horton等［4］发现，Bor不但对各种急性白血病株有效，对白血病原代细胞也具有明显抑制作用，但不同细胞类型对其敏感性略有差异。急性淋巴细胞白血病细胞株敏感性最高，急性髓系白血病原代细胞敏感性最差。Bor单独或联合各种化疗治疗白血病的临床Ⅰ期试验表明［5］，对难治复发的急性白血病患者Bor最大耐受剂量为1.25 mg/m2。在参加试验的15 例中，5 例获得了明显的血液学改善。本研究显示5 nmol Bor作用24 h对HL?60细胞有抑制作用，10 nmol Bor作用72 h抑制作用最强。而10 nmol Bor与1.0 μmol DNR联合应用时，可见HL?60细胞凋亡率比两药单独作用时显著增加，提示Bor对HL?60细胞有时间剂量依赖性的细胞凋亡效应，与DNR联合应时有明显的协同作用。这与国内学者孙启鑫等［6］报道相似。

    Survivin是迄今发现的最强的凋亡抑制因子，因其在肿瘤细胞中广泛表达使其与肿瘤的发生、、治疗及预后的关系越来越受到学者的关注。Carter等［1］发现，AML中有88.9％的患者表达Survivin基因。另一项研究发现，高表达在食管癌细胞中Survivin基因，经蛋白酶体抑制剂处理后表达显著降低［7］。本研究对HL?60细胞经Bor、DNR均使Survivin mRNA的表达下降，且以10 nmol Bor与1.0 μmol DNR两药联合作用的下降为著(P＜0.01)，这就提示Bor对HL?60细胞有抑制作用，且与DNR有协同作用，从另一方面提示Survivin可能是引起白血病细胞凋亡的机制之一，这为临床治疗白血病揭示Bor诱导凋亡机制提供了理论基础。

【】
  ［1］Carter B Z，Milella M，Altieri D C，et al.Cytokine?regulat expnession of survivin in myeloid leukemia［J］.Blood，2001，97(9)：2 784?2 790.

［2］Adida C，Recher C，Raffoux E，et al.Expression and prognostic significance of survivin in de hovo acute myeloid leukemia［J］.Br J Heamatol，2000，111：196?203.

［3］Voorhees P M，Dees E C，Oneil B，et al.The proteasome as a target for cancer therapy［J］.Clin Cancer Res，2003，9：6 316?6 325.

［4］Horton T M，Gannavarapu A，Blaney S M，et al.Bortezomib interactions with chemotherapy agents in acute leukemia in vitra［J］.Cancer Chemother Pharmacol，2005，58：13?23.

［5］Cortes J，Thomas D，Koller C，et al.Phase Ⅰ study of bortezomib in refractory or relapsed acute leukemia［J］.Clin Cancer Res，2004，10：3 371?3 376.

［6］孙启鑫，孟凡义，扶云碧，等.硼替佐米单用或联合三尖杉酯碱体外诱导HL?60细胞凋亡实验研究［J］.实验血液学杂志，2007，15(2)：233?236.

［7］张卫国，谢国建，王启斌，等.泛素?蛋白酶体抑制剂MG?132对食管癌细胞凋亡和生存素表达的影响［J］.中国药房，2005，16(14)：1 055?1 056.