人卵巢癌中多药耐药基因与多药耐药相关蛋白的表达及其临床意义
【关键词】 卵巢癌
［Abstract］ObjectiveTo study the relationship between the expression of multidrug resistance gene（MDR1），multidrug resistance protein（MRP） with the clinical pathological characteristics and the prognosis in the ovarian cancer patients who never received chemotherapy before operation.MethodsThe expression of MDR1 and MRP in 68 cases of ovarian cancer and 20 normal ovary tissue were investigated by reverse transcription?polymerase chain reaction （RT-PCR）.ResultsIn normal ovary and ovarian cancer，the positive of MDR1 was 0 and 35.2%，the positive of MRP was 10.7% and 49.9% respectively.MDR1 and MRP showed significant relationship to the clinical stage and the differentiation of the tumor（P<0.05），but no significant relationship to the histological type（P>0.05）.The non?responders to combination chemotherapy exhibited higher rations of MDR1 and MRP expression than the responders（P<0.05）.ConclusionMulitple gene expression is involved in drug resistance in ovarian cancer.The expression of MDR1 or MRP is higher in ovarian cancer than that in normal ovary tissue.The expression of MDR1 and MRP is closely related to the tumor differentiation and the response to chemotherapy.
［Key words］ovarian neoplasms;genes expression;MDR1;MRP
卵巢癌是女性生殖系统主要的恶性肿瘤之一，其病死率居妇科肿瘤首位，占女性癌症患者病死率的第5位。化疗是卵巢恶性肿瘤的主要辅助手段，但癌细胞的耐药严重妨碍了抗肿瘤药物效能的发挥。国内外研究表明，肿瘤耐药涉及细胞内药物浓度降低、药物靶分子改变、代谢解毒、DNA损伤修复功能增强等多种机制，与多种耐药相关基因有关［1］。本研究采用定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PDR）同时测定多药耐药基因（MDR1），多药耐药相关蛋白（MRP）在卵巢恶性肿瘤组织中表达。旨在探讨卵巢癌MDR1和MRP表达与化疗耐药的关系，从而寻找一种可以预测化疗耐药的标志物。
1资料与方法
1.1一般资料选择2005年1月~2006年12月间在我院妇产科手术治疗的卵巢癌患者共68例，年龄19~65岁，平均51.7岁。所有手术标本均经病理检查证实。另取正常卵巢组织20例作为对照（系子宫肌瘤手术同时切除卵巢获得的正常卵巢组织）。卵巢癌包括子宫内膜样癌10例，透明细胞癌8例，浆液性乳头状囊腺癌（浆液癌）25例，黏液性乳头状囊腺癌（黏液癌）17例，无性细胞瘤2例，内胚窦瘤6例。其中，临床Ⅰ期5例，Ⅱ期9例，Ⅲ期42例，Ⅳ期12例，患者均在术后1周内开始化疗。共接受了6~13个疗程的化疗。化疗方案以CAP（顺铂+阿霉素+环磷酰胺）或泰素加PC（顺铂+环磷酰胺）方案为主。
1.2方法
1.2.1标本收集所有病例均为初诊患者，术前均未接受化疗，在手术切除后1 h内，将新鲜癌组织标本置于液氮中保存。
1.2.2引物设计根据从Genbank中查到的这两种基因序列设计聚合酶链反应（PCR）引物，见表1，内参基因为肌动蛋白（β-actin）。表1PCR引物及产物长度
1.2.3RNA提取参照TRIZOL试剂盒（美国GIBCOBRL公司）说明书进行提取RNA。
1.2.4逆转录（RT）合成CDNA将RNA稀释为1 μg/μl。取5 μl RNA加5×RT buffer 4 μl，dNTP （2 mmol/L）1 μl，Oligo（dT）（100 μg/μl）2 μl，三蒸水3 μl，65 ℃水浴变性5 min，加Rnasin（20 u/μl）0.5 μl，AMV（10 u/μl） 1 μl，（均为美国Promega公司产品）。42 ℃水浴60 min。95 ℃ 5 min灭活AMV。
1.2.5PCR扩增扩增体系：10×buffer 1μl，dNTP （2 mmol/L）1 μl，引物（5 μmol/l）各1 μl，甲酰胺5 μl，Cdna 100ng，TagDNA聚合酶（4 μg/μl）0.3 μl，加三蒸水补充体积至10 μl。94 ℃变性5 min后进入循环，94 ℃变性40 s，55 ℃（68 ℃）退火40 s，72 ℃延伸1 min，30个循环后72 ℃ 10 min。
1.2.6电泳80V电压下，2%琼脂糖凝胶电泳1 h，紫外光下检查有无特异条带。
1.2.7PCR产物定量分析用KODAK数字成像系统对PCR产物照相，用软件分析条带吸光度值。
1.2.8临床疗效评定标准对化疗反应的评价WHO标准［2］，观察至少6个疗程。临床完全缓解（CR）：临床症状消失，盆腔检查及B超检查均无包块，血清CA125值下降至正常；临床部分缓解（PR）：临床症状消失，病灶缩小>50%，无疾病进展表现，血清CA125值较术前明显下降但未达正常；临床无效（NR）：临床症状存在，病灶缩小<50%，盆腔检查或B超检查有包块，病灶增大或复发，血清CA125值未下降或下降后又再升高。若病情在3个月内急剧加重，视为无效。CR和PR均视为临床治疗有效，NR为临床治疗无效，即为耐药。
1.3统计学方法用SPSS统计软件进行χ2检验。
2结果
2.1MDR1与MRP的表达MDR1在正常卵巢组织和卵巢癌组织中的阳性表达率分别是0和35.2%。MRP在正常卵巢组织和卵巢癌组织中的阳性表达率分别是10.7%和49.9%。
2.2MDR1与MRP的表达与临床分期和病理的关系
2.2.1MDR1与MRP的表达与临床分期见表2。表2不同临床期别的卵巢癌中MDR1与MRP的阳性表达情况从表1中看出，Ⅲ期和Ⅳ期中MDR1与MRP的阳性表达率明显高于Ⅰ期和Ⅱ期，但由于Ⅰ期和Ⅱ期例数少（不足10例），两者比较，差异无统计学意义。
2.2.2MDR1与MRP的表达与病理见表3。表3不同病理特征中卵巢癌MDR1与MRP阳性表达情况注：*例数少于10例者不计百分率
从表3中可以看出MDR1在浆液癌中阳性表达率低于其他类型卵巢癌，但仅与透明细胞癌比较差异有显著统计学意义（P<0.05）。MRP在各型卵巢癌中阳性表达率差异无统计学意义（P>0.05）。低分化卵巢癌的MDR1与MRP的阳性表达率分别是48.8%和68.3%，明显高于中、高分化卵巢癌的7.4%和29.6%（P<0.05）。
2.3MDR1与MRP表达与化疗耐药68例接受化疗患者中，术后1年，42例临床治疗有效，26例临床治疗无效，视为临床耐药。临床Ⅲ期接受化疗患者42例，23例临床治疗有效，19例临床治疗无效，视为临床耐药。两者的年龄、病理类型、病理分化程度、手术切除程度、化疗方案以及疗程数比较均无明显差异。23例临床治疗有效者MDR1与MRP的阳性表达率分别是13.04%和34.78%，19例临床治疗无效者MDR1与MRP的阳性表达率分别是52.63%和89.47%，化疗有效者和化疗无效者MDR1与MRP的阳性表达率比较，其差异有统计学意义（P<0.05）。临床Ⅳ期接受化疗患者12例，5例有效，7例无效。两者的年龄、病理类型、病理分化程度、手术切除程度、化疗方案以及疗程数比较均无明显差异。5例有效者中MDR1阳性表达者1例，MRP阳性表达者2例。7例无效者中MDR1阳性表达者3例，MRP阳性表达者5例。
3讨论
肿瘤耐药是多基因参与的结果，了解耐药基因的表达，对于选择合适的方案，判断预后和寻找有效的逆转肿瘤耐药的方法都是有益的。
3.1化疗耐药与MDR1表达的关系MDR1是第1个确定的多药耐药相关基因，基因编码了相对分子量为170000的P-糖蛋白（P-gp）。P-糖蛋白位于细胞浆膜，其作用是将细胞内的一些化疗药物泵出细胞外，从而使肿瘤耐药。这些药物包括长春新碱类、放线菌素类、蒽环类抗生素、鬼臼毒素及衍生物等［3］。国内外的研究表明，正常卵巢组织MDR1基因表达水平极低甚至无表达［4］。我们的研究结果与之一致。本研究中，20例正常卵巢组织中均无MDR1表达，而在68例初诊未经化疗的卵巢癌患者中有35.2%的MDR1基因表达阳性，这些患者MDR1基因的表达非化疗诱导，提示在卵巢癌中可存在固有性的MDR1基因表达。低分化肿瘤的MDR1阳性率为48.8%，显著高于中、高分化肿瘤的7.4%（P<0.01）。提示低分化肿瘤存在原发耐药倾向，MDR1阳性患者的化疗疗效较差。Ⅲ期和Ⅳ期中MDR1的阳性表达率分别是30.9%和33.3%，高于Ⅰ期和Ⅱ期。浆液性囊腺癌中MDR1的表达是16.0%，低于其他类型卵巢癌。临床Ⅲ期化疗有效者MDR1阳性表达率是13.04%，明显低于化疗无效者。以上几项数据说明MDR1阳性表达与临床期别、病理类型和化疗疗效也有关。
3.2化疗耐药与MRP表达的关系MRP是近几年发现的与药物转运有关的耐药相关蛋白。MRP和P-gp同属ATP依赖性跨膜转运蛋白，MRP表达增强可以使细胞主动将进入细胞内的药物排出细胞外，导致细胞内药物浓度减低，改变药物在细胞内的分布［1，5］。Kavallaris等［6］采用RT-PCR测定了53例初治卵巢癌的MDR1和MRP表达，结果36.0%表达MDR1，但表达量较低，而所有患者均表达，其中92.0%卵巢癌患者的MRP表达量高于正常卵巢组织，但未证实MRP表达与预后有关。Izquierdo等［7］采用免疫组化法测定了57例临床Ⅲ~Ⅳ期的卵巢癌组织，患者在细胞减灭术后均接受了以铂类和烷化剂为主的化疗，结果发现MRP和P-gp的阳性表达率分别为68.0%和16.0%，MRP和P-gp的阳性表达率与化疗疗效和生存期无关。本研究中，MRP在正常卵巢组织中的阳性表达率为10.7%，明显低于卵巢癌组织中的49.9%（P<0.05）。本研究中发现MRP的表达与临床期别、病理类型、病理分化程度和化疗疗效均有关。根据研究结果并结合分析，MDR1与MRP的阳性表达水平和临床分期、肿瘤病理分化程度等临床因素与化疗敏感性有一定关系，有可能成为筛选化疗药物、判断患者预后的重要指标。因此有必要进行深入的相关研究，进一步证实MDR1与MRP在耐药中的作用，这对于阐明耐药机制并逆转耐药、提高卵巢癌的化疗疗效、改善预后均有重大的意义。
【文献】
1Sood AK，Buller RE.Drug resistance in ovarian cancer:from the laboratory to the clinic.Obstet Gynecol，1998，92:312-319.
2World Health Organization （eds）.WHO handbook for reporting results of cancer treatment.Geneva WHO，1979.
3Biedler JL，Genetic aspects of multidrug resistance.Cancer，1992，70:1799.
4Cordon-Cardo C，Boccia J，Casals D，et al.Expression of the multidrug resistance gene product（P-glycoprotein） in human normal and tumor or tissues.J Histochem Cytochem，1990，38:1277.
5Coukos G，Rubin SC.Chemotherapy resistance in ovarian cancer:newmolecular perspectives.Obstet Gynecol，1998，91:783-792.
6Kavallaris M，Leary JA，Barrett JA，et al.MDRI and MRP gene expression in epithelial ovarian tumors.Cancer Letter，1996，102:7-16.
7Izquierdo MO，Van Zee AG.Drug resistance-associated marker LRP for prediction of response to chemotherapy and prognoses in advanced ovarian carcinoma.J Natel Cancer Inst，1995，87:1230-1237.
