肺炎新生儿血清二肽基肽酶水平的检测及免疫评价价值的探讨

                    作者：李征，卢宪梅，刘燕，邓景惕，李文

【摘要】  目的 检测肺炎新生儿血清二肽基肽酶（DPP Ⅳ/CD26）水平并探讨其在免疫评价中的价值，以寻找灵敏可靠的新生儿免疫评价指标。方法 免疫比色法检测肺炎组（64例）和对照组（30例）血清DPP Ⅳ/CD26水平，并测定两组的T细胞亚群（CD3+T%,CD4+T%,CD8+T%）和免疫球蛋白(IgG)水平。结果 肺炎组血清DPP Ⅳ/CD26水平显著低于对照组（P＜0.01），且与CD3+T%,CD4+T%及日龄呈正相关。结论 血清DPP Ⅳ/CD26较T细胞亚群（CD3+T%,CD4+T%,CD8+T%）和IgG更为敏感，可作为新生儿免疫评价指标。

【关键词】  婴儿，新生；肺炎；二肽基肽酶；T细胞亚群；免疫球蛋白；免疫

    ［Abstract］  Objective  To investigate the level and influential factors of dipeptidyl peptidase  Ⅳ/CD26 (DPP  Ⅳ/CD26）in serum of neonates with pneumonia in order to offer a sensitive index evaluating the immune function of nenates.Methods  Colorimetric method was employed to detect DPP  Ⅳ/CD26 in the pneumonia group (64 cases) and control group (30 cases).T cell subset （CD3+T,CD4+T,CD8+T） and immunoglobulin(IgG) were  also detected.Results  The level of DPP  Ⅳ/CD26 in the pneumonia group was significantly lower than the control group （P＜0.01）and shew a positive correlation with CD3,CD4 and age.Conclusion  DPP  Ⅳ/CD26 is much more sensitive than T cell subset（CD3+T,CD4+T,CD8+T） and immunoglobulin(IgG) and can be used to evaluate the immune level of neonates.

    ［Key words］  infant,newborn;pneumonia;dipeptidyl peptidase  Ⅳ/CD26;T cell subset;immunoglobulin;immune

    长期以来，人们总是将T细胞亚群（CD3+T%,CD4+T%,CD8+T%）和免疫球蛋白(IgG,IgM,IgA)作为免疫评价指标，新生儿也不例外。然而，新生儿免疫系统发育不完善，虽然T细胞绝对计数已达成人水平，功能方面却明显不足；同时，免疫球蛋白中绝大部分来源于母亲，自身合成的各类免疫球蛋白量都很少，甚至难以测出［1，2］。因此，单纯检测T细胞数量和Ig含量评价新生儿免疫水平特异性不高。

    二肽基肽酶（dipeptidyl peptidase  Ⅳ/CD26，DPP Ⅳ/CD26）是110kD的Ⅱ型细胞膜糖蛋白，因在跨

    膜信号传导及T、B细胞活化过程中的重要作用而被认为是T、B细胞的活化标志。许多与免疫调节有关的免疫调节激素、细胞因子，如P物质、神经肽Y、糖脂蛋白-1（glycolipoprotein-1，GLP-1）、调节活化正常T 细胞表达与分泌的趋化因子（regulated on activation normal T-cell expressed and secrected，RANTES）等也被证实是DPP Ⅳ/CD26的水解底物，其免疫功能越来越受到人们的重视 ［3~6］。

    本文主要检测肺炎新生儿的血清DPP Ⅳ/CD26水平，探讨其与其他临床指标的关系，以期能为临床新生儿免疫水平的评价提供可靠指标。

    1  资料与方法

    1.1   一般资料  取我科新生儿病房64例感染性肺炎患儿为肺炎组，纳入标准：具有呛奶、气促、口吐泡沫、口周及鼻根部发青、肺部呼吸音粗等症状和体征，经胸部摄正位X线片证实肺炎存在；排除肝胆疾病、糖尿病、吸入性肺炎、免疫性疾病及其他感染性疾病。取我院产科30例正常足月分娩新生儿为对照组，以上两组性别、日龄、胎龄及体重均无显著差异，具有可比性。表1  肺炎组与对照组的临床资料对比注：*为肺炎组与对照组性别组成的χ2检验值

    1.2  标本采集  两组新生儿均于股静脉采血，并分作3份。第一份3 000 r/min离心5 min后取血清保存于-80 ℃冰箱内，用于DPP Ⅳ/CD26的检测，另外两份分别于8 h内用于检测T细胞亚群和血免疫球蛋白。

    1.3  试验方法  血清DPP Ⅳ/CD26的检测：取5 μl待测血清，与71 mM Gly/NaOH (pH 8.3)、0.5 mg/ml的显色底物Gly-Pro-p-硝基苯胺(Sigma，St.Louis,USA)配成100 μl混合液，加入微孔板。每个标本均做复孔。37 ℃培养1 h后，于酶标仪（Labsystems,Finland ）405 nm波长下读数测定。通过P-硝基苯胺水平酶活性，以每分钟水解1 μmol底物的酶量作为酶的活性单位（U）。T细胞亚群采用流式细胞仪(Becton Dichinson FACS Vantage，USA)测定。血免疫球蛋白采用美国Beckman公司 Array360 特种蛋白仪进行分析。

    1.4  统计学方法  所有数据以（x±s）的形式表示，应用SPSS 13.0软件进行统计分析，两组的各指标比较采用χ2检验进行分析，DPP Ⅳ/CD26与各指标之间采用双变量相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

    2  结果

    2.1  肺炎组与对照组血清DPP Ⅳ/CD26、T细胞亚群及免疫球蛋白的比较  见表2。肺炎组与对照组的血清DPP Ⅳ/CD26、CD3+T%、CD4+T%均有显著差异,但血清DPP Ⅳ/CD26水平差异明显高于后两者（t=2.757,P＜0.01；t=-2.167,P＜0.05；t=-2.019,P＜0.05）；两组CD8+T%、IgG水平差异无统计学意义（t=1.288,P＞0.05；t=0.882,P＞0.05）。由于体内含量过低，IgM和IgA缺失值过多，未统计。表2  肺炎组与对照组血清DPP Ⅳ/CD26、T细胞亚群及Ig水平比较 注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

    2.2  DPP Ⅳ/CD26与其他指标的相关性分析  见表3。经双变量相关分析，血清DPP Ⅳ/CD26水平与日龄显著正相关（r=0.604，P＜0.01），与CD3+T%、CD4+T%成正相关（r=0.701，P＜0.05；r=0.631，P＜0.05），与CD8、IgG、性别、体重不具有相关性。 表3  血清DPP Ⅳ/CD26与各指标的相关性分析

    2.3  DPP Ⅳ/CD26及其他指标与日龄的相关性比较  见表4。血清DPP Ⅳ/CD26水平与日龄显著正相关，而CD3+T%、CD4+T%、CD8+T%、IgG与日龄无明显相关性。 表4  血清DPP Ⅳ/CD26及其他指标与日龄的相关性比较

    3  讨论

    1984年Schon在人外周血淋巴细胞表面发现DPP Ⅳ/CD26，首次揭示了DPP Ⅳ/CD26的免疫功能［7］。研究发现，DPP Ⅳ/CD26可作为协同刺激分子传递跨膜信号，并进一步促使T细胞活化。由于DPP Ⅳ/CD26胞质尾区只有6个氨基酸序列，活化信号的传递需要TCR/CD3、CD2等信号分子的协助才能完成［3，8］。有关DPP Ⅳ/CD26活化T细胞的具体机制还不明确，现普遍认为酪氨酸磷酸酶/CD45、腺苷脱氨酶（adenosine deaminase,ADA）等酶类可能在其中发挥重要作用［3，9］，而DPP Ⅳ/CD26的酶活性并不参与T细胞活化过程［4］。有学者认为［8，10］，DPP Ⅳ/CD26可激活CD45的磷酸酶活性，促进c-Cbl,ZAP70,Erk1/2,p56Lck,TCR/CD3 ξ链等T细胞活化信号的酪氨酸活化基序（tyrosinebased activation motif，ITAM）磷酸化，提高细胞内Ca2+浓度，扩大体内的免疫反应信号，促进T细胞活化。DPP Ⅳ/CD26-ADA复合物的形成则可促进胸腺细胞的成熟和分化并延缓T细胞的凋亡。Ruiz等在试验中发现DPP Ⅳ/CD26的活性随胸腺细胞的成熟而逐渐升高，于CD4+ T/CD8+ T单阳性细胞达最高,并在CD4+ T细胞优先表达［8，11，12］，证实了DPP Ⅳ/CD26在T细胞发育过程中的重要作用。Fan等［4］通过DPP Ⅳ/CD26基因敲除小鼠证实DPP Ⅳ/CD26缺陷可导致CD4+ T细胞的发育和成熟障碍，同时还可降低IgG、IgE的浓度，但IgM的浓度没有明显变化，说明DPP Ⅳ/CD26也参与B细胞活化过程。

    大量研究已证实［13］，肺炎新生儿免疫水平明显受抑，T细胞亚群以CD3+T、CD4+T降低最为明显，而IgG含量变化不大。本研究发现肺炎组DPP Ⅳ/CD26水平的下降较CD3+T、CD4+T更为显著，且经相关性分析，DPP Ⅳ/CD26与CD3+T%、CD4+T%变化趋势一致，说明DPP Ⅳ/CD26可更灵敏、有效地反映新生儿免疫功能。同时由于DPP Ⅳ/CD26与日龄具有更显著的相关性，使其较CD3+ T%、CD4+T%更能适应新生儿免疫功能动态变化的特点［14，15］。另外，本研究发现，DPP Ⅳ/CD26不受性别、体重的影响，这与Christine Durinx等［5］的报道基本一致，他们的研究发现性别、体重、血压、妊娠次数、激素等对DPP Ⅳ/CD26均无明显影响。考虑本实验中DPP Ⅳ/CD26与IgG不具有相关性的原因，与新生儿体内IgG含量低且绝大多数为通过胎盘由母体获得有关。

    本文肺炎新生儿血清DPP Ⅳ/CD26的检测结果显示DPP Ⅳ/CD26可灵敏反映不同周龄新生儿的免疫功能，尤其是活化T细胞水平，而不仅仅反映T细胞数量的多少，同时也可反映活化B细胞的水平，弥补依靠检测Ig含量反映B细胞功能的不足，且不受性别、体重等因素的影响,这与新生儿免疫功能不成熟、变化快的特点相适应。因此，血清DPP Ⅳ/CD26对评价新生儿的免疫水平具有重要的临床意义。

【】
  1 金汉珍，黄德珉，官希吉.实用新生儿学，第3版.北京：人民卫生出版社，2002，917-919.

2 陈同辛，何振娟，吴圣楣，等.CD抗体诱导的新生儿脐带血淋巴细胞信号传导的研究.中华微生物学和免疫学杂志，2003，30(1)：17-21.

3 Simeoni L,Rufini A,Moretti T,et al.Human CD26 expression in transgenic mice affects murine T-Cell populations and modifies their subset distribution.Human Immunology,2002,63:719-730.

4 Fan H,Yan S,Stehling S,et al.Dipeptidyl peptidase Ⅳ/CD26 in t cell activation,cytokine secretion and immunoglobulin production.Advances in Experimental Medicine And Biology,2003,524:165-174.

6 Durinx C,Neels H,Van der Auwera,et al.Reference Values for plasma dipeptidyl-peptidase Ⅳ activity and their association with other laboratory parameters.Clin Chem Lab Med,2001,39(2):155-159.

7 Schon E,Demuth HG,Barth A,et al.Dipeptidyl peptidase Ⅳ of human lymphocytes.Evidence for specific hydrolysis of glycylproline p-nitroanilide in T-lymphocytes.Biochem J,1984,223(1):255-258.

8 Morimoto C,Schlossman SR.The structure and function of CD26 in the T-cell immune response.Tmmunoiogical Reviews,1998,161:55-70.

9 Von Bonin A，Huhn J，Fleischer B.Dipeptidyl-peptidase Ⅳ/CD26 on T cells:analysis of an alternative T-cell activation pathway.Immunological Reviews，1998，161:43-53.

10 Ishii T,Ohnuma K,Murakami A,et al.CD26-mediated signaling for T cell activation occurs in lipid rafts through its association with CD45RO.PNAS,2001,98(21):12138-12143.

11 Dang NH,Torimoto Y,Shimamura K,et al.1F7 (CD26):a marker of thymic maturation involved in the differential regulation of the CD3 and CD2 pathways of human thymocytes activation.J Immunol,1991,147:2825.

12 Ruiz P,Zacharievich N,Hao L,et al.Human thymocyte dipeptidyl peptidase Ⅳ (CD26) activity is altered with stage of ontogeny.Clin Immunol Immunopathol,1998,88:156.

13 陈昌辉，叶长宁，李茂军，等.新生儿感染性肺炎的临床和免疫功能研究.中华儿科杂志，2003,41(12):884-888.

14 Levy O.Innate immunity of the newborn:basic mechanisms and clinical correlates.Nature Review Immunology,2007,7(5):379-390.

15 Satwani D,Morris E,Carmella van de Ven,et al.Dysregulation of expression of immunoregulatory and cytokine genes and its association with the immaturity in neonatal phagocytic and cellular immunity.Biology of the Neonate,2005,88:214-227.