应用重组合异种骨促进前交叉韧带重建术后腱-骨愈合的研究

               作者：潘玮敏，胡蕴玉，魏义勇，毕龙，曹峥，刘民，杨小彬 

【摘要】  [目的]通过影像学、组织学及生物力学手段探讨重组合异种骨(RBX)对前交叉韧带重建术后腱-骨愈合的影响。[方法]25只新西兰白兔，利用双侧趾长伸肌肌腱重建前交叉韧带(ACL)，其中一侧移植物两端固定有RBX，另一侧作为对照组，分别于术后2、6、12周取材，进行Micro?CT扫描，组织学染色(包括HE、甲苯胺蓝)以及生物力学检测，观察腱-骨之间愈合状况。[结果]影像学结果显示，术后6、12周RBX组腱-骨之间的骨矿化组织密度(BMD)数值均高于对照组，并具有显著性差异;组织学结果显示，术后2周，RBX组腱-骨之间被大面积不规则分布的软骨样细胞填充;术后6周，治疗组的腱-骨之间已见大量成熟软骨细胞，并开始分泌基质。而对照组术后腱-骨间一直被纤维样结缔组织连接，至术后12周，治疗组部分标本出现类ACL正常肌腱止点。生物力学结果同样证实，RBX组的最大牵拉力均显著高于对照组。[结论]RBX可显著提高ACL重建术后腱-骨之间的愈合，较早恢复膝关节功能。

【关键词】  重组合异种骨; 前交叉韧带重建; 肌腱; 骨道; 腱骨愈合

　　Abstract：[Objective]To investigate the effect of reconstituted bone xenografts (RBX) on tendon?to?bone healing by means of imaging,histological and biomechanical studies.[Method]Anterior cruciate ligament (ACL) reconstruction was performed bilaterally in 25 skeletally mature rabbits using long digital extensor tendon grafts.RBX were implanted into the treated knee of each rabbit,with the contralateral knees as controls.Every three rabbits were killed at 2,6 and 12 weeks postoperatively for routine histological studies.The samples were processed through Micro CT and subsequent HE and toludine blue staining.The remaining 16 rabbits were sacrificed at 6 and 12 weeks.Their femur?tendon graft?tibia complexes were harvested for subsequent mechanical testing.[Result]At 6 and 12 weeks after operation,the values of BMD in the RBX group were higher than those in the control group (P<0.05).Histological findings of the interface between the tendon and bone were different in the two groups.Two weeks after operation,large areas of chondrocyte?like cells that were fairly disorganized were noted between the tendon and bone in the treatment group.Six weeks after operation，more abundant bone formation around the tendon was observed and at 12 weeks,an immature insertion structure was seen in the treatment group.In biomechanical evaluation,the maximum pull?out load of the tendon from the bone tunnel in the treatment group was significantly higher than that in the control group 6 and 12 weeks after operation.[Conclusion]RBX can augment the healing of tendon to bone after ACL reconstruction in a rabbit model.

　　Key words： reconstituted bone xenografts; reconstruction of anterior cruciate ligament; tendon grafts; bone tunnel; tendon to bone healing

　行前交叉韧带(anterior cruciate ligament，ACL)重建术时，常用骨-髌腱-骨(bone?patellar tendon?bone，BTB)移植术，由于术后供区并发症的问题，多数骨科医生转而使用半腱肌和股薄肌肌腱自体移植物，然而自体肌腱移植物术相比BTB重建需要较长时间才能获得良好的生物力学功能。Wickiewicz TL[1]提出大约10%的患者重建术后出现关节不稳，认为这是由于骨隧道内腱-骨愈合不良所致，而腱-骨愈合的时间与质量决定了重建术后膝关节的功能。因此如何促进腱-骨间愈合成为学者关注的重点。

　　Redeo等[2]研究发现，在腱-骨愈合的过程中，骨向肌腱方向的长入占主要地位,而且腱骨结合部生物力学的获得也与新生骨长入程度相关。因此加快肌腱移植物周围骨长入是提高腱-骨愈合的重点。国内外实验研究已采用多种方法促进骨的长入，例如在腱骨结合部注入生长因子，骨髓基质干细胞等[3，4]，但在临床的应用中都受到一定的限制。本实验采用集骨诱导性及骨传导性为一体且在临床应用取得良好效果的重组合异种骨(reconstituted bone xenograft，RBX)来促进腱-骨愈合，以提高ACL重建术后膝关节功能的尽早恢复。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物分组

　　新西兰大白兔25只(第四军医大学动物实验中心提供)，雌性，体重2.7 kg±0.2 kg。双侧分别行趾长伸肌肌腱重建ACL悬吊固定模型。其中一侧植入RBX，另一侧不用RBX作为对照。动物分别于术后2，6，12周处死。

　　1.2 前交叉韧带(ACL)重建动物模型

　　实验兔使用846复合麻醉剂0.2～0.4 ml/kg 体重肌注后，仰位固定消毒。切开单侧膝关节和内侧支持带，向外侧脱位髌骨，充分暴露前交叉韧带并完全切除。分离并切取趾长伸肌肌腱，剔除肌性部分后，肌腱两端使用可吸收缝线将RBX紧密固定于两侧[5]，然后使用3-0 Vicryl缝线缝编，留约10 cm缝线作为牵引线。在胫骨侧，自胫骨隆突向ACL胫骨原止点打一条直径2.5 mm的骨隧道;通过该骨道再向上、向外、向后至髁间窝外侧壁后部，靠近股骨原ACL止点向股骨外髁外侧打一条直径相同的骨隧道。用18G针头引导其分别通过胫骨及股骨隧道，先在股骨隧道缝合，反复打结以嵌压于股骨隧道皮质外，于屈膝位30°拉紧，再在胫骨侧缝合、收紧，在胫骨隧道外口反复打结嵌压于胫骨隧道皮质外;对照组不施加RBX。随后逐层关闭切口，消毒。术后不附加外固定，自由笼养。

　　1.3 术后检测

　　1.3.1 显微CT(Micro?CT)检测 取材标本在行组织学检测之前，置于三维显微CT(eXplore Locus SP，GE,USA)内进行扫描,主要观察腱-骨结合部新生骨组织的BMD(mg/ccm)。扫描条件为largetube_14 um_150 min_ss。

　　1.3.2 组织学检测 术后2、6、12周分别处死实验兔，取胫骨和股骨标本置于10%甲醛缓冲液中固定、脱钙、石蜡包埋，平行于骨髓道方向纵行切片。分别进行HE，甲苯胺蓝染色，光镜下(Leica LA,Germany)主要观察骨隧道与移植肌腱结合部的交界组织。

　　1.3.3 生物力学检测 术后6、12周分别处死8只实验兔，于膝关节处离断股骨和胫骨,得到完整的膝关节标本。除保留重建的前交叉韧带外，去除标本上的所有组织连接,将胫骨及股骨端分别固定于AGS型(Shimadzu Corporation,JAPAN)生物力学检测仪特定夹具两端,以 50 mm/min的垂直拉力进行牵拉试验至肌腱从骨隧道中脱出,此时的牵拉力为腱骨结合面所能承受的最大牵拉力(N)。

　　1.4 统计学分析

　　所有数据采用平均值±标准差表示，使用SPSS 11.0统计学软件进行数据处理。统计方法选用单因素方差分析。P<0.05认为差异具有显著性意义。

　　2 结 果

　　2.1 显微CT检测结果

　　显微CT结果显示RBX可明显促进新生骨长入。治疗侧术后6周，腱骨结合部新生骨组织BMD值(101.7285±17.2138)mg/ccm，明显大于对照组之(68.9320±11.7996)mg/ccm;12周，治疗组BMD值为(152.5065±52.5724)mg/ccm，而对照组仅为(108.7622±14.4342)mg/ccm(P<0.05)。

　　2.2 组织学结果

　　见图1。光镜下观察到骨隧道内不同时间腱-骨结合部愈合的不同进展。术后2周，对照组骨隧道内骨与肌腱移植物之间有明显间隙，二者之间被含有血管的纤维结缔组织填充，大量梭形成纤维细胞向腱组织中生长。而治疗组则显示二者之间被大面积不规则分布的软骨样细胞填充，尽管这些细胞仍显示不成熟状态。6周时，对照组腱-骨结合部仍然被纤维结缔组织填充，而治疗组腱-骨结合部已见大量成熟的软骨细胞，而且开始分泌软骨样基质。整个界面呈现新骨组织包围肌腱并向内侵入的趋势。12周，对照组腱-骨结合部组织界面连接变狭窄，有部分显示Sharpey's样纤维连接二者。治疗组则显示新生骨与肌腱界限不清，不易分辨，有些标本呈现不成熟的类ACL正常止点连接结构，包含纤维软骨和钙化软骨。

　　2.3 生物力学检测结果

　　生物力学检测结果见表1。6、12周最大牵拉力结果显示组均明显大于对照组。同时发现，随愈合时间的延长，移植肌腱断裂位置也有所变化。6周时，测试每组8个标本，对照组有6个、治疗组有7个从胫骨侧拉出。至12周时，对照组中有1例从胫骨侧拉出，其余标本均在肌腱中部断裂。表1 最大牵拉力(N)测量结果

　　3 讨 论

　　前交叉韧带重建的关键是促进移植肌腱在骨隧道内的愈合,从而早期恢复膝关节功能。实验证实,骨隧道内新生骨向移植肌腱方向生长的过程类似骨折愈合的过程[6]。因此有学者提出，为使肌腱移植物与骨隧道之间，即腱骨结合部较快达到生物愈合，可以应用组织工程学技术促进其再生[6]。此外，骨隧道内大量存在的骨髓，提供了组织工程技术所需的多分化潜能细胞，在这种条件下应用合适的生长因子及恰当的支架材料即可加速骨的生长。学者们分别使用了液态或凝胶状的支架材料I型胶原、液态磷酸钙及纤维蛋白胶分别与rhBMP-2、BMP-7、BMP粗提物以促进肌腱移植物与骨隧道之间的愈合[7～10]。然而理想的BMP载体支架材料除了维持一定时间内的BMP浓度外，还必须提供力学的支持，上述液态或凝胶状载体支架材料难以提供可以维持组织生长的力学强度，因此修复并不理想。而且新生骨的形成及生物材料的降解，与材料本身的孔隙率及结构有很大的关系，固态立体结构且多孔隙的载体不仅促进细胞的迁移、贴附及分化，也可为BMP充分作用于靶细胞提供足够的三维空间。

　　RBX是将去抗原的牛松质骨作为载体，再与从同源的皮质骨中提取的BMP相结合而制成的新型植骨材料，经系列动物实验及大量临床研究[11]，证明RBX既具有高效诱导成骨活性和骨传导作用，又不引起免疫排斥反应。其支架不仅具有互通、规则的孔隙结构，有利于新生骨组织的长入，而且由于RBX的支架部分来源于骨组织，因此其中的基质部分不仅有利于细胞的聚合，而且可起到缓释BMP的作用，从而提高了BMP作为骨诱导成分的作用。本实验结果证实，RBX治疗组中骨隧道内腱-骨之间的愈合明显优于对照组，其生物来源的三维结构支架及BMP，可诱导募集而来的骨髓基质干细胞在支架上向成骨方向分化，从而促进新骨的生长。

　　另一方面，力学因素在腱-骨愈合过程中也起重要的作用。Yamakado[12]将兔趾长伸肌肌腱的股骨端切断后植入垂直于胫骨干的骨隧道内，观察腱骨愈合情况。结果证明，肌腱在骨隧道内不同部位的愈合情况与移植物的应力分布有关：张应力对腱-骨愈合起促进作用，压应力可促进软骨形成，切应力对愈合几乎无影响。本实验中，治疗组从手术时开始即应用具有三维结构的RBX，使得肌腱与骨隧道之间一直存在压应力及一定的张应力，而且伴随新骨的产生，压应力持续存在，在整个过程中治疗组较对照组更早、更多地生成软骨样细胞，从而提高新骨的生成。

　　有两点需要说明，本实验选取趾长伸肌肌腱作为重建ACL的移植物材料，这是国内外学者在兔ACL重建模型中常规选择的移植物[13，14]。其次，作者在本试验中并未设置单纯的松质骨治疗组，因为在实验设计之初就将RBX作为一个整体对待，前期的实验中我们已证实单独的松质骨骨粒仅能充当载体，并无促进成骨的表现。通过本实验研究发现，应用RBX可以显著促进ACL重建术后腱-骨间的愈合，然而移植肌腱在骨隧道内的愈合是一个复杂的过程，其相关机制还有待于进一步的研究。

【】
  　　[1] Wickiewicz TL.Revision ACL reconstruction[R].Proceedings of the American Academy of Orthopaedic Surgeons 64th Annual Meeting,San Francis,1997.

　　[2] Rodeo SA,Arnoczky SP,Torzilli PA,et al.Tendon? healing in a bone tunnel.A biomechanical and histological study in the dog[J].J Bone Joint Surg(Am),1993,75:1795-1803.

　　[3] Anderson K,Seneviratne AM,Izawa K,et al.Augmentation of tendon healing in an intra?articular bone tunnel with use of a bone growth factor[J].Am J Sports Med,2001,29:689-698.

　　[4] Ouyang HW,Goh JC,Lee EH.Use of bone marrow stromal cells for tendon graft?to?bone healing:histological and immunohistochemical studiesin a rabbit model[J].Am J Sports Med,2004,32:321-327.

　　[5] Liu SH,Kabo JM,Osti L.Biomechanics of two types of bone?tendon?bone graft for ACL reconstruction[J].J Bone Joint Surg(Br),1995,77:232-235.

　　[6] Forward AD,Cowan RJ.Tendon suture to bone:an experimental investigation in rabbits[J].J Bone Joint Surg(Am),1963,45:807-823.

　　[7] 李 彬.韧带-骨交界处组织理化特性及相关组织工程学策略[J].矫形外科杂志,2008,18:1399-1401.

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　　[11]胡蕴玉，陆裕朴，刘 玮.异种骨移植修复骨缺损实验研究[J].中华骨科杂志,1990,1:33-36.

　　[12]Yamakado K,Kitaoka K,Yamada H,et al.The influence of mechanical stress on graft healing in a bone tunnel[J].Arthroscopy,2002,18:82-90.

　　[13]Shaieb MD,Singer DI,Grimes J,et al.Evaluation of tendon?to?bone reattachment:a rabbit model[J].Am J Orthop,2000,29:537-542.

　　[14]Kyung HS,Kim SY,Oh CW,et al.Tendon?to?bone tunnel healing in a rabbit model:the effect of periosteum augmentation at the tendon?to?bone interface[J].Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc,2003,11:9-15.