体外微团培养兔骨髓间充质干细胞形成软骨细胞
作者：李斌 张伟 王健 孙水 吴帅
【摘要】 ［目的］探讨兔骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）体外诱导形成软骨细胞的方法，以及转化生长因子-β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）、胰岛素样生长因子-Ⅰ(insulin-like growth factor-Ⅰ，IGF-Ⅰ)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor ，bFGF)之间的相互作用。［方法］对兔骨髓间充质干细胞体外进行原代和传代培养，按加入诱导条件不同分为四组：A组：TGF-β1+ bFGF；B组：TGF-β1+ IGF-Ⅰ；C组：TGF-β1；D组：空白对照组。3周后分别做四唑盐（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）比色试验、糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）检测和免疫组织化学染色。［结果］A、B、C三组Ⅱ型胶原免疫组织化学检测阳性；MTT吸光度值和GAG含量检测结果均为：A组>C组>D组， B组>C组>D组，统计学有显著差异。［结论］兔BMSCs在一定条件下可以诱导成软骨细胞，TGF-β1和IGF-Ⅰ、bFGF在BMSCs向软骨细胞分化和增殖时起协同作用。
【关键词】 骨髓间充质干细胞 软骨细胞 转化生长因子-β1 胰岛素样生长因子-Ⅰ 碱性成纤维细胞生长因子
Abstract: ［Objective］To study the methods of inducing bone mesenchymal stem cells（BMSCs）of rabbits into chondrocytes in vitro and the interaction of transforming growth factor β1（TGF-β1）, insulin-like growth factor-Ⅰ（IGF-Ⅰ) and basic fibroblast growth factor （bFGF). ［Methods］BMSCs of rabbits were primarily cultured and subcultured in vitro, and then divided into four groups according to the difference of factors: group A receiving TGF-β1 and bFGF; group B receiving TGF-β1 and IGF-Ⅰ; group C receiving TGF-β1; group D receiving no cell growth factor. After three weeks all the four groups were detected by methyl thiazolyl tetrazolium（MTT） assay,measurement of glycosaminoglycan (GAG) and immunohistochemistry. ［Results］Immunohistochemical detection of collagen Ⅱ was positive in groups A, B and C.The results of the MTT assay and the GAG content in groups A and B were obviously higher than those in groups C and D.［Conclusion］Rabbit BMSCs can be induced into chondrocytes under certain conditions.TGF-β1, IGF-Ⅰ and bFGF have synergy effect in the differentiation from BMSCs into chondrocytes.
Key words：bone mesenchymal stem cells; chondrocytes; transforming growth factor-β1; insulin-like growth factor-Ⅰ; basic fibroblast growth factor
由于软骨内没有血管，成熟软骨细胞有丝分裂能力低下等原因，软骨的自我修复能力非常有限，所以由创伤和退变等所引起的关节软骨损伤成了临床上无法解决的难题。在传统的关节软骨钻孔、自体软骨膜、骨膜移植和自体的骨软骨移植都没有取得良好效果的情况下，组织工程为关节软骨损伤的修复带来了一线曙光。骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）取材简单，体外增殖能力强，并且具有多向分化潜能，成为了软骨组织工程理想的种子细胞。本研究旨在探讨骨髓间充质干细胞体外向软骨细胞分化的条件以及转化生长因子-β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）、胰岛素样生长因子-Ⅰ(insulin-like growth factor-Ⅰ，IGF-Ⅰ)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor ，bFGF)之间的相互作用。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物为健康新西兰大白兔，雌雄不限，2～3个月龄，体重2.0～3.0 kg，由山东省农科院提供。
1.1.2 实验试剂
TGF-β1、IGF-Ⅰ和bFGF均购自Peprotech公司；密度为1.131 g/ml的Percoll分离原液购自Sigma公司；Dulbecco’s Modified Eagle Media (DMEM)购自Hyclone公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；胰蛋白酶购自华美生物制品公司；Ⅱ型胶原免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。
1.1.3 实验器材
培养板和培养瓶：Hyclone公司；CO2恒温培养箱：美国Nuaire公司；倒置显微镜：日本Olympus公司；超净工作台：苏州净化设备公司；离心机：北京医用离心机厂；分光光度计：Duseries600，USA；酶联标记检测仪：Multiskan MS，芬兰。
1.2 实验方法
1.2.1 兔BMSCs的体外分离和培养
取2～3个月龄健康新西兰大白兔麻醉毕，无菌条件下穿刺髂骨成功后接上10 ml空针，内含3 000 U/ml的肝素0.4 ml，抽取骨髓6～8 ml。将肝素骨髓与等体积的D-hanks液混合，洗涤去除脂肪。经1.073 g/ml的Percoll分离液密度梯度离心后（2 500 r/min,20 min）,吸取单个核细胞层，D-hanks洗涤后收集细胞，接种到含有完全培养基4 ml（低糖DMEM、10%胎牛血清、青霉素钠100 U/ml、链霉素100 μg/ml）的培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、5%CO2的培养箱中培养。3 d后半量换液，以后每3 d全量换液一次。培养的原代细胞12～14 d铺满瓶底，用0.25%的胰酶消化，1 000 r/min离心6 min，收集细胞，按1∶3的比例传代，命名为P1。P1传代细胞培养到铺满瓶底时消化、收集细胞再进行传代培养，命名为P2。
1.2.2 兔BMSCs的高密度微团诱导培养和分组
P2传代细胞长满瓶底时，消化、收集细胞，用高糖DMEM悬浮，调整细胞浓度为1×106/ml。在每个60 mm培养皿中各分布6滴细胞悬液，每滴100 μl，在37℃、饱和湿度、5%CO2的培养箱中静置2 h后再缓慢加入诱导液。按加入诱导液的不同分为四组：A组：TGF-β110 ng/ml+bFGF10 ng/ml；B组：TGF-β110 ng/ml+IGF-Ⅰ10 ng/ml；C组：TGF-β110 ng/ml ；D组：空白对照组。四组均加入地塞米松10-7 mmol/ml，VitC 50 μg/ml，含10%胎牛血清的高糖DMEM。每3 d换液1次，共培养14 d。
1.2.3 四唑盐（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）比色试验检测细胞增殖率
将四组加入不同诱导液的BMSCs培养14 d，胰酶消化，收集细胞并调整细胞浓度为1×104 /ml，接种于96孔板，每组5孔，每孔200 μl，再加入各组不同的诱导液200 μl。3 d换液1次， 7 d后每孔加入200 μl MTT，培养4 h，弃上清液，每孔加入150 μl二甲基亚枫，震荡10 min，用酶联标记检测仪490 nm波长测定吸光度值。
1.2.4 糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）含量检测
将四组加入不同诱导液的BMSCs培养14 d，胰酶消化，收集细胞并调整细胞浓度为1×104 /ml，接种于96孔板，每组5孔，每孔200 μl，再加入各组不同的的诱导液200 μl。3 d换液1次，7 d后取上清液，以硫酸软骨素为标准品，紫外分光光度计制作标准曲线，阿利新蓝法检测上清液中GAG含量。
1.2.5 Ⅱ型胶原免疫组织化学检测
将四组加入不同诱导液的BMSCs诱导14 d后，胰酶消化，收集细胞并调整细胞浓度为1×105/ml，接种于24孔板（每孔底部已加入预处理过的细胞爬片）中，每组5孔，每孔400 μl，继续培养7 d，弃上清液，取出载玻片做免疫组化：甲醛室温固定20～30 min，PBS（pH 7.2～7.6）洗涤一遍；0.1%TritonX-100破膜40 min，PBS（pH 7.2～7.6）冲洗一遍；3%H2O2室温浸泡10 min，PBS（pH 7.2～7.6）冲洗5 min×3次；加入封闭用正常山羊血清工作液浸泡细胞10 min，加一抗前吸除；添加稀释的一抗（兔抗人Ⅱ型胶原抗体IgG）,4℃过夜，37℃30 min复苏，PBS（pH 7.2～7.6）冲洗5 min×3次；滴加二抗（生物化山羊抗兔IgG）, 37℃固定10 min，PBS（pH 7.2～7.6）冲洗5 min×3次；滴加试剂S-A/HRP，37℃ 10 min，PBS （pH 7.2～7.6）洗5 min×3次；DAB显色；苏木素轻度复染，自来水冲洗干净；酒精分化，返蓝，脱水，晾干封片。结果观察： BMSCs定向分化为软骨细胞的阳性表现为细胞浆内棕黄色细密颗粒，光镜下BMSCs细胞的胞浆染成黄色或棕黄色为阳性信号，在20×10视野下，每张爬片随机取6个视野阳性细胞数，并以x-±s表示。
1.2.6 统计学方法
采用SPSS 13.0统计软件包，单因素方差分析，数值以x-±s表示，以P﹤0.05表示差异有显著性意义。
2 结果
2.1 细胞形态学变化
原代细胞培养24 h就可见少量细胞贴壁，呈短梭形散在分布。3 d后贴壁细胞明显增多，多为短梭形或成纤维细胞样，偶有多角形和扁平状的，有小的集落形成（图1）。到第7 d时，集落明显增大，变多，细胞呈长梭形，随后细胞生长迅速形成明显的克隆，克隆逐渐向四周扩展，集落间相互融合，12～14 d铺满瓶底（图2）。传代后的细胞不再以集落方式生长，而是均匀分布，呈长梭形，但增殖加快，6～7 d就铺满瓶底。高密度的微团培养在倒置相差显微镜下可见BMSC在培养皿底部局部密集 ,细胞排列成多层，使单个细胞的轮廓不清楚（图3），A、B、C组细胞团的边缘细胞增殖迅速，5～7 d后可见到细胞逐渐变为多角形或多边形，体积增大，胞浆内颗粒增多，细胞核间隙增大，以A组和B组明显（图4、5），诱导14 d，细胞形态明显改变，成不规则形，胞质内颗粒丰富，D组仅表现为细胞团边缘的细胞增殖，始终呈稠密的长梭形。
2.2 MTT检测细胞增殖率诱导培养后第21 d各组吸光度值（表1）。表1 细胞椅子对BMSCs细胞增殖率的影响组别标本数吸光度值A组（略）
单因素方差分析：F=91.117,P<0.01。进一步四组行两两比较：A组与B组，P=0.845>0.05；A组与C组，P<0.01；A组与D组，P<0.01；B组与C组，P<0.01；B组与D组，P<0.01；C组与D组，P<0.01。
2.3 GAG含量检测诱导培养后第21 d四组培养上清液中GAG的含量（表2）。表2 细胞因子对BMSCs分泌糖胺聚糖（GAG）的影响（略）
单因素方差分析：F=108.68,P<0.01。进一步四组行两两比较：A组与B组，P=0.934>0.05；A组与C组，P<0.01；A组与D组，P<0.01；B组与C组，P<0.01；B组与D组，P<0.01；C组与D组，P<0.01。
2.4 Ⅱ型胶原免疫组织化学检测诱导培养后第21 d，A、B、C组多数细胞阳性染色，以A组和B组最多（图6、7），D组极个别细胞阳性信号。在20×10视野下，每个视野平均阳性细胞数（表3）。
3 讨论
种子细胞是组织工程研究的关键因素之一，是工程化组织形成的物质基础。干细胞是各种组织细胞的最初来源，它具有高度自我复制、高度增殖、多向分化等特征，按来源不同可分为胚胎干细胞和成体干细胞，本实验所用的BMSCs即为成体干细胞的一种。BMSCs目前已经成为软骨组织工程最理想的种子细胞［1、2］，它具有以下优点：（1）穿刺髂骨、股骨、胫骨均可得到，取材方便，来源充足，对机体损伤小；（2）采用密度梯度离心结合贴壁筛选和传代的方法即可纯化，易于分离培养；（3）体外增殖力强，可以大量扩增；（4）具有多向分化能力［3］，在一定条件下可以转化为软骨细胞；（5）由自体BMSCs诱导成的软骨细胞移植时属于自体移植，不发生免疫排斥反应等。
BMSCs向软骨细胞诱导的方法包括体外高密度微团培养、体外单层细胞培养、体外三维支架环境诱导［4］、与软骨细胞体外共培养诱导和基因转染诱导培养等。作者认为软骨细胞的诱导成功必须满足两个条件：（1）较高的细胞密度；（2）三维的立体环境。本实验采用了体外高密度微团培养法，它模拟人体内软骨发育时的状态，提供了三维立体环境，细胞聚集成团，形成内部相对缺氧的环境，有利于高密度的细胞粘附、增殖，有利于细胞之间的信号传递，也可使细胞分泌的细胞外基质固守在细胞的附近，充分发挥细胞外基质对细胞增殖、分化及代谢的调节作用，为维系细胞的生长和代谢提供适宜的微环境。1×106ml的细胞密度也满足了BMSCs向软骨细胞转化的最低细胞密度要求。
细胞因子也是组织工程中的重要因素，它通过细胞间信号传递来影响细胞的活动，具有促进或抑制细胞分裂、增殖、迁移和基因表达等作用。目前常用于诱导BMSCs向软骨细胞转化的细胞因子有TGF-β、IGF、FGF和骨形态发生蛋白（bone morphogenetic factor,BMP）等，本实验选用了TGF-β1、IGF-Ⅰ和bFGF。TGF-β是一族具有多种功能的蛋白多肽，具有促进细胞增殖、调节细胞分化、促进细胞外基质合成和分泌的作用［5］。它在软骨细胞发育的不同阶段起的作用也不相同，在软骨细胞未分化或分化早期，它能促进其DNA合成、增殖、分化和外基质的合成；对于成熟的软骨细胞，它能抑制其增殖和分化，抑制外基质的分解代谢，不改变细胞的表型。TGF-β在哺乳动物组织有三种存在形式：TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，Barry等［6］认为 TGF-β2和TGF-β3的诱导成软骨细胞作用均强于TGF-β1。IGF包括IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ两个成员，它们结构相似但功能有很大的不同。IGF-Ⅰ可以促进软骨细胞DNA合成，加快细胞增殖和成熟，并合成软骨基质蛋白多糖；而IGF-Ⅱ只是能够促进间充质干细胞（mesenchymal stem cells， MSCs）的葡萄糖代谢。 FGF家族有酸性成纤维细胞生长因子、bFGF、FGF3、FGF4等多个成员。bFGF主要是通过旁分泌机制发挥作用，是目前发现的最强的促细胞生长因子，可以促进MSCs增殖，促进软骨细胞前质的分化以及软骨细胞的增殖和成熟。
BMSCs体外诱导形成软骨细胞是一个非常复杂的过程，细胞因子在这个过程中起了非常重要的作用。本实验对各种细胞因子诱导BMSCs形成软骨细胞的作用和细胞因子之间的相互作用进行了探索。通过比较四组的实验结果，发现除了D组，其余三组形态学上都可见到类软骨细胞形成，GAG含量检测和Ⅱ型胶原免疫组织化学检测可以证实其为软骨细胞，尤其是Ⅱ型胶原免疫组织化学检测，因为Ⅱ型胶原是软骨细胞合成的特异的主要的胶原成分。这就说明A、B、C三组的诱导方法都可以使BMSCs诱导成为软骨细胞，而这三组有一个共同点就是都含有TGF-β1，恰恰缺乏TGF-β1的D组没有明显的软骨细胞形成，这足以证明TGF-β1在诱导BMSCs成为软骨细胞的重要性。值得一提的是诱导液中加入地塞米松和VitC的必要性，地塞米松可以结合MSCs上的糖皮质激素受体并激活之，从而促进MSCs向软骨细胞分化，抑制其向脂肪细胞分化；VitC其本身并不能使MSCs发生转化，但它可以使细胞分泌的外基质有机的组成与排列，有利于细胞发挥自分泌与旁分泌作用，保证内外源因子的传输，具有非特异的促进细胞增殖与转化的作用。
本实验还得出这样一个结果，使用TGF-β1+ bFGF组合和TGF-β1+ IGF-Ⅰ组合的组别的细胞增殖率、GAG含量和Ⅱ型胶原免疫组织化学检测阳性表达均明显高于单独使用TGF-β1组和空白对照组，并且从形态学上来说，分别加用bFGF和IGF-Ⅰ组别的软骨细胞的增殖和分化均较其他两组明显，说明TGF-β1和 bFGF、TGF-β1和IGF-Ⅰ在诱导BMSCs形成软骨细胞的过程中具有协同作用。这与Fukumoto等［7］的结论相符合。
软骨组织工程关节软骨损伤具有广阔的前景。本实验通过探讨BMSCs体外诱导形成软骨细胞的方法以及各种细胞因子之间的相互作用为将来组织工程的临床应用提供实验依据。当然，本实验只是软骨组织工程的一小部分，得到的软骨细胞如何进行体内组织构建还需要进一步研究。
【】
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