新型镁合金皮内刺激与致敏实验研究
作者：王飞，王钢 孟祥翔，张永君，张大保
【摘要】 [目的]通过动物皮内刺激及致敏试验，对镁合金AZ91D(AZ0)、Mg-Mn-Ce(RE0)及其在三种不同阶跃式阳极氧化表面改性条件下所得新型镁合金(AZ1、AZ2、AZ3、RE1、RE2、RE3)的体内生物相容性进行初步的评价。[方法]按照GB/T16886.10-1997《医疗器械生物学评价》刺激与致敏试验方法进行。采用与生理盐水、高纯镁及医用钛合金Ti-6A1-7Nb对照的研究方法，将镁合金浸提液注入豚鼠皮肤内观察皮内反应：采取皮内注射和涂皮相结合的诱导法观察豚鼠致敏反应。[结果]RE2由于成膜效果较差，无法制备浸提液，剔除出试验组。皮内刺激试验：生理盐水组、Ti-6Al-7Nb、AZ1、AZ3炎性反应I级，评分0分;其余试样皮内刺激反应稍重，有少许充血水肿(Ⅱ级)，评分1分。致敏试验：甲醛组炎症反应重(Ⅳ级)，肉眼观局部皮肤坏死结痂，致敏4级;生理盐水组无明显炎症反应(Ⅰ级)，致敏0级;Ti-6Al-7Nb、AZ1、AZ3炎症反应Ⅱ级，红斑及水肿轻微(Ⅰ级);余试验组炎症反应Ⅲ级，致敏2级。[结论]由以上结果可以初步认为，新型镁合金AZ1、AZ3在皮内刺激及致敏试验中表现较好，具备良好的生物相容性，有望成为新一代的骨科植入材料。
【关键词】 镁合金; 刺激; 致敏; 生物材料; 阶跃式阳极氧化
Abstract: [Objective]To evaluate the biocompatibility in vivo of Mg alloy AZ91D(AZ0),Mg-Mn-Ce (RE0) and their step anodizational materials (AZ1, AZ2, AZ3, RE1, RE2,RE3) by the experiments of intradermal stimulus and sensitivity response. [Methods]According toGB/T 16886.10-1997 Biological Evaluation of Medical Apparatus and Instrument, compared with normal sodium, pure magnesium and medical Ti-6Al-7Nb, the leaching liquor were injected into cutis to evaluate stimulus response，to evaluate sensitivity response by injection and illinition.[Results]RE2 could not prepare leaching liquor, it’s kicked out. Intradermal stimulus response:normal sodium,Ti-6A1-7Nb, AZ1,AZ3 groups inflammation responded as degree I, scored 0. The others inflammation responded as degree Ⅱ, scored 1. Sensitivity response: formaldehyde group inflammation responded as degree IV, erythema and edema were degree IV. Normal sodium group inflammation responded as degree I, erythema and edema were degree 0. Ti-6Al-7Nb, AZ1,AZ3 groups inflammation responded as degree Ⅱ, erythema and edema were degree 1. The others inflammation responses were degree Ⅲ, erythema and edema were degree Ⅱ.[Conclusion]The new kinds of magnesium alloy AZ1, AZ3 possesses good preliminary biocompatibility in vivo, so it is very possible to be a new type of bone surgery implant material.
Key words：Mg alloy; stimulus; sensitivity; biomaterial; step anodization
随着生物医学的，金属材料的应用日益增多。目前骨科临床各种置换、植入器械主要以钛合金(Ti-6Al-7Nb)为主。但钛合金价格昂贵，作为骨科内固定材料，其密度及弹性模量与骨组织有一定差距，易出现“应力遮挡”效应，不利于骨折愈合。镁合金因其资源丰富、价格低廉、安全性高、生物学性能及力学性能好，已越来越受到骨科及材料学专家的关注。然而，镁合金化学性质活泼，耐腐蚀性能差。而耐腐蚀性差的材料在作为内固定材料时，骨折尚未愈合，其自身已降解，达不到固定效果。国内学者[1]通过阶跃式阳极氧化表面改性方法来提高其耐腐蚀性能，希望能解决这一难题。但改性后的镁合金生物相容性状况如何尚不清楚。本实验通过国家医疗器械生物学评价中的试验方法初步评测其体内生物相容性，为其应用于临床提供。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 金属材料 镁合金AZ91D(AZ0)、Mg-Mn-Ce(RE0)及其在三种阶跃式阳极氧化条件下制备的材料(分别标记为AZ1、AZ2、AZ3、RE1、RE2、RE3)、高纯镁(H)、医用钛合金Ti-6Al-7Nb(Ti)，大小6 mm×5 mm×2 mm，以上材料均由华南理工大学提供。依次用无水乙醇浸泡脱脂， 超声波清洗器清洗15 min，三蒸水冲洗3遍，热风烘干后，在121℃下， 高压蒸汽灭菌20 min备用。
1.1.2 实验动物与试剂 豚鼠80只(皮内刺激试验32只，致敏试验48只)，雌雄各半，无皮肤疾病或者损伤，体质量平均350 g，2个月龄。由南方医科大学附属南方动物实验中心提供(许可证：SCXK粤2006-0015)，开放系统动物饲养环境。完全弗氏佐剂(广州威佳科技有限公司)，甲醛、100 g/L十二烷基硫酸钠石蜡液。
1.2 实验方法
1.2.1 浸提液制备 金属材料浸提液采用0.9%的无菌生理盐水，试件按表面积(cm2)与生理盐水体积(ml)之比为3∶1，置于37℃培养箱内72 h使金属离子尽可能多的析出，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，制备出材料浸提液。
1.2.2 皮内刺激试验 试验前24 h，剃除豚鼠背部4～6 cm区域毛发。体积分数为0.7的(V/V)乙醇消毒。在豚鼠脊柱两侧无毛区各选择2个点，每两点至少间隔2 cm。H为阳性对照组，Ti为阴性对照组，生理盐水为空白对照组。四点随机注射0.1 ml试验组、阳性对照组、阴性对照组浸提液以及生理盐水。观测指标：注射后24、48及72 h检查注射部位，观察注射局部及其周围皮肤组织的反应，根据皮肤出现红斑水肿的情况记分，取注射部位皮肤10%甲醛固定，将固定组织石蜡包埋切片，苏木精-伊红染色。镜下观察炎症细胞种类及反应分级。
1.2.3 致敏试验 将上述浸提液、生理盐水和体积分数为0.05的甲醛溶液分别与完全弗氏佐剂等容积混合，用力搅拌至乳化完全为止。采用皮内注射和涂皮相结合的诱导法。将48只豚鼠随机分为试验组36只(AZ组、RE组、H组均4只)、空白对照组(生理盐水)4只、阴性对照组(Ti)4只和阳性对照组(体积分数为0.05的甲醛溶液)4只。试验前24 h，剃除豚鼠背部4～6 cm区域毛发。体积分数为70%的乙醇消毒，在每只豚鼠背脊柱两侧6点对称皮内注射，各点相距2.0 cm，每点注射剂量为0.1 ml。注射物质和位置见图1。皮内注射1周后，在豚鼠剃毛区再次剃毛，体积分数为70%乙醇清洁。各注射部位以100 g/L十二烷基硫酸钠石蜡液(SIJS)涂布，24 h后贴敷于标准材料浸提液、阴性和阳性对照液中浸泡至饱和的2 cm×4 cm滤纸片进行第2次致敏，固定并留置48 h。14 d后，将豚鼠腹部一侧毛发剃除，体积分数为70%乙醇清洁，贴敷同前滤纸片并固定24 h进行激发。观测指标：除去贴敷物24 h后观察腹部激发部位皮肤反应或疹块发生，取腹部皮肤10%甲醛固定，将固定组织石蜡包埋切片，苏木精-伊红染色。镜下观察炎症细胞种类及反应分级。 图1豚鼠背部注射物质和位置。a：生理盐水与完全弗氏佐剂的等体积乳化物：b：材料浸提液、阴性或者阳性对照液;c：材料浸提液、阴性或者阳性对照液与完全弗氏佐剂的等体积乳化物
2 结果
2.1 浸提液制备情况 浸提RE2的生理盐水几乎完全消耗，无法制备浸提液。RE2试样表面生成大量乳白色粉末状附着物(经监测为MgO)。Ti制备的浸提液清澈，未见任何杂质，试样外观无改变。其余试样制备的浸提液正常，内含极少量乳白色絮状沉淀物，试样表面棱角部位镀膜少许脱落，无附着物生成。
2.2 皮内反应试验
2.2.1 评估标准 皮肤炎症细胞分级参照表1，反应积分标准见表2(得分根据红斑水肿情况相加得出)。
表1 炎症细胞反应纤维囊厚度分级标准级别炎症细胞反应I级试样周围未见或仅见极少量淋巴细胞Ⅱ级试样周围可见少量淋巴细胞Ⅲ级试样周围有少量嗜中性粒细胞，淋巴细胞浸润和巨细胞反应Ⅳ级试样周围可见以嗜中性粒细胞浸润为主的炎症反应，可见吞噬细胞
表2 皮内刺激反应评分表分值分值红 斑水 肿0无红斑无水肿1轻度红斑(勉强可见)轻度水肿(勉强可见皮肤增厚)2中度红斑(明显可见)中度水肿(明显隆起)3重度红斑重度水肿(隆起lmm，轮廓清楚)4紫红色红斑并有轻微焦痂形成严重水肿(隆起>lmm并有扩大)
2.2.2 肉眼观察 生理盐水、Ti、AZ1、AZ3注射部位皮肤肉眼观察无红斑，未见水肿，皮内刺激反应评分0分;其余试样注射部位皮肤存在零星的轻度红斑、轻微水肿，皮内刺激反应评分1分。
2.2.3 组织学观察 各注射部位皮肤取材，常规HE染色后切片观察(图2)显示，生理盐水、Ti、AZ1、AZ3注射部位皮肤未见炎症细胞，组织未见充血、水肿、坏死，炎症细胞反应I级。其余试样注射部位存在少量淋巴细胞，组织轻度充血水肿，无坏死，炎症细胞反应Ⅱ级。
结果表明AZ1、AZ3与阴性对照(Ti-6A1-7Nb)及空白对照(生理盐水)无任何差异，无皮肤刺激反应。其余试验组及阳性对照材料相较与AZ1、AZ3稍差，皮内刺激反应尚可。 图2豚鼠背部皮内注射3 d组织学观察(HE染色，×100)
2.3 致敏试验
2.3.1 评估标准 按照表3记录激发部位红斑和水肿反应分级，炎症细胞分级参照表1。
表3 皮肤致敏分级标准红斑反应分级水肿反应无红斑0无水肿极轻微的红斑(刚可察出)1极轻微水肿(刚可察出)局限性红斑(淡红色)2轻微水肿(边缘和高度均局限)中度红斑(鲜红色，区域清晰)3中度水肿(边缘升高近1mm)严重红斑(紫红色，形成轻微焦痂)4严重水肿(高度>1mm，边界超过接触区)
2.3.2 肉眼观察 甲醛组腹部激发部位皮肤明显坏死结痂，致敏反应严重，分级为4级。生理盐水组腹部激发部位无红斑及水肿，致敏分级为0级。Ti、AZ1、AZ3腹部激发部位红斑、水肿极轻微(1级)。余试样腹部激发部位皮肤有局限性红斑及轻度水肿，致敏反应2级。
2.3.3 组织学观察 各组取腹部激发部位皮肤常规HE染色切片(图3)显示，甲醛组细胞坏死，淋巴细胞较明显聚集在坏死区及周边部位，炎症反应为Ⅳ级。生理盐水组无炎症细胞聚集，无充血水肿，炎症分级为I级。Ti、AZ1、AZ3有少量淋巴细胞聚集，未见明显充血水肿(Ⅱ级)，余实验组组织内存在中等量炎性细胞，充血水肿稍明显，炎症反应分级Ⅲ级。
结果显示Ti、AZ1、AZ3致敏反应较空白对照组稍差，较其余试验组好。Ti与AZ1、AZ3之间无明显差异，AZ1、AZ3无明显的致敏作用。
3 讨论
不锈钢、钴基合金、钛合金、镍钛形状记忆合金和磁性合金等金属材料已经成为医学临床尤其是骨科中(如脊柱矫形、断骨接合、颅骨修补等)应用最广的承力植入材料。但上述金属材料医用过程中仍存在与宿主的力学相容性和生物相容性问题。机械性能不匹配将产生“应力遮挡”效应，导致骨质疏松、骨吸收或骨萎缩，出现二次骨折。生物相容性问题主要来源于金属植入物的生理腐蚀、磨损，这会严重威胁宿主健康[2～5]。
镁合金以其独特的优势受到科技界和界的青睐，如：资源丰富，价格便宜，具有理想的比强度和比刚度，密度1.4～1.9 g/cm3，与人骨的密质骨密度(1.75 g/cm3)基本相当;杨氏模量约为45 GPa，接近人骨的弹性模量(10～40 GPa)，能有效地缓解“应力遮挡”效应[6]。另外镁是人体内仅次于钙、钠和钾的常量元素，并且是人体所必需的元素之一，参与体内一系列新陈代谢过程[7]。Christopher Hansi[8]认为镁合金作为心血管支架的涂层，可以减少血栓，改善支架的生物相容性。F.Witte[9]通过研究发现镁有促进成骨作用，认为镁合金适合制作人工骨或骨内固定物。但镁合金的化学性质活泼，耐腐蚀性能差。如果植入机体，在骨折愈合之前其自身已降解，则起不到固定作用。张永君等[1、10]通过阶跃式阳极氧化表面改性技术有效地增加镁合金的耐腐蚀性及耐磨性，减缓了镁合金的降解，使其有望成为一种新型的生物医用材料。但通过此技术处理后的镁合金的生物相容性如何，尚不得知。本试验采用与现在临床上应用甚广、生物相容性良好的Ti-6Al-7Nb对照，通过动物实验研究改性后镁合金的皮内刺激与致敏反应，以此初步评价其体内生物相容性，比较具有说服力。 图3豚鼠腹部激发后1 d组织学观察(HE染色，×100) 图3a为AZ0 图3b为AZ1
图3e为RE0 图3fRE1图3g为RE3 图3h为H 图3i为Ti 图3j为甲醛 图3k为生理盐水 红色箭头指示部位为炎症细胞明显聚集或充血水肿部位，蓝色箭头显示细胞坏死区域 皮内刺激与致敏反应是评价体内生物相容性的常用方法。本实验参照GB/T16886.10-1997《医疗器械生物学评价》标准(刺激与致敏试验方法)进行，保证了实验的规范性和结果的准确性。浸提液的方法亦按照此标准进行，在浸提时间上予以适当的延长，以保证使材料中的离子析出的更多，更真实的模拟体内植入环境。RE2制备浸提液时，浸提介质(生理盐水)几乎耗尽，无法进行下一步实验，故予以剔除出试验组。原因分析可能由于RE2成膜效果不佳，Mg2+暴露与介质中H2O较快反应消耗介质所致。皮内刺激试验结果显示，AZ1、AZ3与阴性对照(Ti-6Al-7Nb)及空白对照(生理盐水)无任何差异，不会造成皮肤刺激反应。其余试验组及阳性对照组比AZ1、AZ3稍差，皮内刺激反应尚可。致敏试验结果显示，虽然AZ1、AZ3较空白对照组(生理盐水)稍差，但与阴性对照组(Ti)无显著差异。AZ1、AZ3比其他试验组的结果要理想，与阳性对照组(甲醛)差异显著。由此可见，新型镁合金AZ1、AZ3符合临床对于材料致敏反应的要求。
本实验初步证明了新型镁合金材料AZ1、AZ3具有良好的体内生物相容性，有望进一步为一种新型的骨科内植入材料。但仅仅通过皮内刺激与致敏试验来证明其生物相容性是不够的，尚需进行进一步的研究予以证实和完善。急性全身毒性试验和长期植入试验是ISO(10993)和我国国家标准(GB/T16886)规定的常用体内生物相容性测试方法。通过急性全身毒性试验及长期植入试验来进一步研究阶跃式阳极氧化表面改性镁合金的体内生物相容性，并由此为镁合金阳极氧化技术的改进提供指导，是后期进一步研究的方向。
【】
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