腹腔注射褪黑素受体拮抗剂对鸡脊柱发育的影响
作者：杨志洲，杨成伟，高瑞，李明，朱晓东
【摘要】 [目的]探讨鸡腹腔内注射褪黑素受体拮抗剂对鸡脊柱发育的影响。[方法]刚孵育出的国产绍兴小鸡45只，随机分为3组，每组15只。(1)对照组：在孵化3 d后控制白天12 h光照(光照度为500 lx)、夜间12 h完全黑暗(光照度为0～5 lx)条件下饲养。(2)手术组：在孵化后3 d时施行松果体切除术，光照条件同对照组。(3)拮抗剂组，在孵化3 d后，每天腹腔注射褪黑素受体拮抗剂30 mg/kg，光照条件同对照组。[结果]3个月时对照组及拮抗剂组未发生脊柱侧凸，手术组共有7只小鸡发生了脊柱侧凸。[结论]松果体切除可以减少褪黑素的分泌，并诱导部分鸡发生脊柱侧凸。给予褪黑素MELl-a受体的拮抗剂Luzindole阻止褪黑素的作用并不能产生实验性脊柱侧凸。
【关键词】 受体; 褪黑素; 脊柱侧凸
Abstract: [Objective]To observe the growth of the spine of chickens after injection of the antagonist of the MEL1-a receptor of melatonin to restrain the effect of melatonin. [Methods]Forty-five newborn Little-Shaoxing chickens were divided in three groups: (1) Fifteen chickens (control group) were kept in light-dark (12h: 12h) cycle, 500 1x in daytime and 0-5 1x in nighttime. (2) Fifteen chickens (operative group) received pinealectomy when they were 3 days old. They were kept in the same light condition as the control group. (3) Fifteen chickens (antagonist group), a antagonist of the MEL1-a receptor of melatonin (Luzindole, 30mg/kg) was injected abdominally every day when they were 3 days old. They were kept in the same light condition as the control group. Radiologic examinations were performed for all chickens.[Results]No chickens developed scoliosis in control group and antagonist group. Seven chickens developed scoliosis in the operative group when the chickens were 3 months old.[Conclusion]Pinealectomy can reduce the secretion of melatonin and induce scoliosis in some of the chickens. But injection of Luzindole to restrain the effect of malatonin cannot induce experimental scoliosis in chickens.
Key words：receptor; melatonin; scoliosis
国内外研究证实[1、2]，将孵化不久的小鸡松果体切除可以导致脊柱侧凸，并且这种脊柱畸形与人类特发性脊柱侧凸极其相似。另外，报道了肌肉内移植松果体以及腹腔内注射褪黑素可以防止切除松果体小鸡脊柱侧凸的，否则，这种脊柱畸形将进一步加重[3、4]。因此，学者们推测褪黑素的合成或代谢障碍是导致实验性脊柱侧凸的原因。但是，低水平的褪黑素如何影响肌肉系统目前存在着种种猜测，Kennaway[5]发现在兔的脊柱上有褪黑素作用的位点，认为是褪黑素直接作用于这些位点，通过复杂的作用调节脊柱两侧生长的对称性。本实验使用褪黑素受体的拮抗剂来抑制褪黑素的作用，观察鸡脊柱的发育情况，对褪黑素受体的作用进行初步探讨。
1 材料与方法
1.1 动物分组
将45只雌性国产绍兴小鸡分笼饲养，所有笼子均放置于一间温度控制在28℃～32℃的房间内。小鸡的饮食与商用养鸡场相同，饲料中并不含有褪黑素以及与褪黑素相关的5-HT(五羟色氨)等物质。将动物随机分为3组，每组15只。(1)对照组：在孵化3 d开始控制白天12 h光照(光照度为500 1x)、夜间12 h完全黑暗(光照度为0～5 1x)条件下饲养。(2)手术组：在孵化后3 d施行松果体切除术，控制光照条件同对照组。(3)拮抗剂组：在孵化3 d后，每天腹腔注射褪黑素MEL1a受体拮抗剂(Luzindole，美国CE公司)，连续3个月，剂量为30 mg/kg。控制光照条件同对照组。
1.2 麻醉及手术方法
硫贲妥钠(50 mg/kg)腹腔注射全麻后，在小鸡头顶部作一正中切口，切开皮肤。用7号刀片刮除其表层的筋膜，可减少渗血，在额骨和顶骨融合部位作一个方形的切口，形成一个方形颅骨瓣。切开硬膜窦，暴露松果体，通过精细的显微手术镊摘除松果体，最后将颅骨瓣复位，不缝合，关闭皮肤切口。
1.3 X线检查
3个月时，所有动物使用过量的硫贲妥钠(100 mg/kg)注射后处死。进行X线摄片，测量并记录脊柱侧凸的发生率及程度。脊柱侧凸的判定标准为前后位片上侧凸角度(Cobb’s法)大于10°。
2 结果
对照组在饲养过程中有1只死于腹泻，拮抗剂组有1只死于腹腔注射后感染。手术组中除2只死于术中大出血之外，其余均健康存活。死亡动物被排除在研究之外。
对照组和拮抗剂组无1例发生脊柱侧凸。手术组13只鸡松果体切除术后3个月有7只发生了脊柱侧凸，发生率为53.8%。其主侧凸角度为11°～54°，平均26.2°。胸段右侧凸4只，胸段左侧凸1只，胸腰段右侧凸2只(图1)。 图1手术组中1只发生了胸段右侧凸鸡的X线片，其主侧凸角度为50°
3 讨论
3.1 褪黑素是一种由色胺酸通过4种酶的一系列作用而产生的吲哚类物质，主要由松果体分泌产生。近年来的研究发现，褪黑素除了参与调节昼夜节律、体温、性成熟、免疫和心血管系统功能之外，还参与调节脊柱发育的对称性。并且前期研究表明，切除鸡松果体可以产生脊柱侧凸，人们推测褪黑素可能在特发性脊柱侧凸的发病中起着重要作用[6]，但目前对褪黑素受体在此过程中作用仍未明确。目前发现褪黑素受体广泛分布于中枢神经系统，其膜受体有MEL1a、MEL1b、MEL1c等3种，有关褪黑素受体在脊柱侧凸动物致病中的研究也许是特发性脊柱侧凸病因学研究的突破点。
3.2 在大量的实验基础上，Machida等[7]发现褪黑素缺乏可以导致中枢神经系统的紊乱，包括下丘脑、脑干、小脑和脊髓的紊乱，可能会进一步导致躯体的失衡、脊柱和椎旁肌的不对称发育。McInnes[8]报道了在椎体上存在着褪黑素的作用位点。这些位点特征性的含有单一的一种受体。Budden等[9]报道了褪黑素能够促进人工培养的软骨细胞的分化和骨化。Brodner等[10]认为褪黑素可能直接在脊髓的位点上发生作用，并且在兔的中央灰质(X板层)的实验中得到了证实。这些研究结果表明，褪黑素除了对中枢神经系统之外，在调节骨骼生长和椎体塑型方面具有直接的原发作用。而褪黑素受体与脊柱侧凸的关系尚不明确。
3.3 在本实验腹腔注射褪黑素MEL1a受体的竞争性拮抗剂(Luzindole)的剂量为30 mg/kg，之所以选择30 mg/kg的剂量，是因为此剂量能成功阻断小鼠褪黑素的作用[11]。但尽管如此，并没有产生预期的实验性脊柱侧凸模型。因此，松果体切除术所产生的鸡脊柱侧凸模型有可能是不是通过褪黑素的中枢或外周的MEL1a受体起作用的，其它受体是否在脊柱侧凸发病中起作用还需进一步的实验证实。
【】
[1] Porter RW. The pathogenesis of idiopathic scoliosis: uncoupled neuro-osseous growth[J].Eur Spine J，2001，6: 473-481.
[2] 王亭，胡有谷，郑英刚，等.褪黑素在鸡脊柱侧凸模型中的作用[J].中华骨科杂志，2002，10：623-626.
[3] 朱晓东，李明，侯铁胜，等.不同剂量褪黑素对松果体切除鸡脊柱侧凸发生率的影响[J].中华骨科杂志,2004,7：436-438.
[4] Byrd JA. Current theories on the etiology if idiopathic scoliosis[J].Clin Orthop，1998，229:114-119.
[5] Kennaway DJ. Melatonin and development: physiology and pharmacology[J].Semin Perinatol，2000，4:258-266.
[6] 曹洪海，顾苏熙，李明.褪黑素在特发性脊柱侧凸发病中作用的研究进展[J].矫形外科杂志,2006,17：1323-1325.
[7] Brodner W, Krepler P, Nicolakis M,et al.Melatonin and adolescent idiopathic scoliosis[J].J Bone Joint Surg Br，2000，3:399-403.
[8] McInnes E, Hill DL, Raso VJ,et al.Vibratory response in adolesencts who have idiopathic scoliosis[J].J Bone Joint Surg (AM)，1991 ，8:1208-1212.
[9] Budden SS, Gunness ME. Possible mechanisms of osteopenia in Rett syndrome: bone histomorphometric studies[J].J Child Neurol，2003，10:698-702.
[10]Machida M, Dubousset J, Imamura Y,et al.Role of melatonin deficiency in the development of scoliosis in pinealectomised chickens[J].J Bone Joint Surg Br，1995，1:134-138.
[11]Sugawara T, Sieving PA, Iuvone PM,et al.The melatonin antagonist luzindole protects retinal photoreceptors from light damage in the rat[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，1998，12:2458-2465.
