仙灵骨葆对兔膝骨性关节炎治疗作用的研究

          作者：程潭，张柳，李震，李强，穆树林，田发明，刘永强 

【摘要】  [目的]研究仙灵骨葆(xianlinggubao, XLGB)对兔骨性关节炎关节软骨及软骨下骨的保护作用。[方法]30只3个月龄雄性日本大耳白兔，随机分为对照组(Sham)、盐水组(ACLT+NS)和仙灵骨葆组(ACLT+XLGB)，每组各10只。盐水组和仙灵骨葆组行右膝关节前交叉韧带切断术(anterior cruciate ligament transaction, ACLT)造成膝骨性关节炎模型。术后仙灵骨葆组125 mg/(kg·d)灌胃;盐水组则给予等剂量生理盐水。6周后处死动物，取股骨测量骨密度，之后脱钙制片，行HE染色、Mankin评分及BMP-2、MMP-13免疫组化染色;取右膝胫骨近端包埋，制成硬组织切片，用于骨组织形态计量学测量。[结果](1)Mankin评分：仙灵骨葆组显著低于盐水组。(2)股骨远端骨密度及胫骨近端软骨下骨骨量：仙灵骨葆组均显著高于盐水组。(3)免疫组化：仙灵骨葆组MMP-13的表达显著低于盐水组，BMP-2的表达显著高于盐水组。[结论]仙灵骨葆125 mg/(kg·d)灌胃能够部分阻止骨关节炎兔关节软骨的退变，其作用机制可能与下调MMP-13的表达，上调BMP-2的表达，同时增加软骨下骨骨量，改善其微观结构有关。

【关键词】  仙灵骨葆; 骨性关节炎; 软骨细胞; 软骨下骨; BMP-2; MMP-13

　　Abstract: [Objective]To assess the protective effects of Xianlinggubao on articular cartilage and subchondral bone in experimental osteoarthritis induced by anterior cruciate ligament transaction (ACLT)in rabbits. [Methods]Thirty healthy Japanese white rabbits were divided randomly into three groups: sham group, ACLT+XLGB group and ACLT+ NS group. Rabbits in ACLT+XLGB group and ACLT+NS group received anterior cruciate ligament transection(ACLT)on the right knee. Rabbits in sham group received untreatment as control. ACLT+XLGB group received a daily administration of XLGB at a dose of 125 mg/kg of body weight for 6 weeks.In contrast, ACLT+NS group received saline at the same dose. All rabbits were sacrificed at 6 weeks after operation. The right femora were removed, measured for bone mineral density (BMD), and then were observed for the macro-pathologic changes with HE staining and graded by Mankin's scale. Expression levels of BMP-2 and MMP-13 were detected by immunostaining. The subchondral bone of right tibial plateau was cut and stained for the measurement of bone histomorphometry.[Results](1)The Mankin’s score in ACLT+ XLGB group was significantly lower than that in ACLT+ NS group (P<0.05). (2) The BMD of distal femora and subchondral bone mass of proximal tibia in ACLT+ XLGB group was significantly higher than that in ACLT+NS group (P<0.05). (3) In ACLT+XLGB group:the expression level of MMP-13 was significantly lower while BMP-2 was significantly higher than that in ACLT+NS group (P<0.05).[Conclusion]Daily administration of XLGB at a dose of 125 ug/kg/d for 6 weeks can partially decrease the expression level of MMP-13 and increase the expression level of BMP-2.XLBG probably protects articular cartilage by improving the structure of subchondral bone and reducing the degradation of cartilage matrix.

　　Key words：xianlinggubao; osteoarthritis; chondrocyte; subchondral bone; BMP-2; MMP-13

　　骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种以关节疼痛、晨僵及功能损伤造成的活动受限为临床特征的慢性疾病。其病特点为降解代谢胜于合成代谢关节软骨的变性，表现为糜烂、溃疡和脱失、软骨下骨硬化和骨赘的形成。流行病学数据显示[1]在中老年人群中,骨关节炎是一种发病率较高的、非常普通的肌肉骨骼疾病，但目前还没有找到真正能够治愈的方法和药物[1]。研究发现[2～4]，仙灵骨葆(XLGB)对成骨细胞和破骨细胞都具有显著的调控作用，并能改善骨小梁三维结构[5]，可能存在对OA的巨大潜力。

　　本研究旨在观察仙灵骨葆对骨关节炎模型兔关节软骨的保护作用，同时检测软骨下骨量及骨关节炎发生促进因子MMP-13及骨关节炎发生保护因子BMP-2的表达，以期进一步探讨其可能的作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物分组与处理

　　健康3个月龄雌性日本大耳白兔30只(购自北京维通利华公司，批号：SCXK京，2005-0002)。随机分为三组：对照组(Sham)、盐水组(ACLT+NS)和仙灵骨葆组(ACLT+XLGB)。盐水组和仙灵骨葆组行右膝关节前交叉韧带切断术(anterior cruciate ligament transaction, ACLT)。造模术后，ACLT+XLGB组行每日1次仙灵骨葆(贵州同济堂公司)灌胃125 mg/(kg·d)，ACLT+NS组给予等量生理盐水灌胃。Sham组只打开右膝关节，不行前交叉韧带切断术,缝合膝关节。

　　1.2 标本采集和处理

　　三组实验动物于6周后处死并取材。将胫骨近端固定于70%酒精，冠状面锯开胫骨，脱水固定，经甲基丙烯酸甲脂包埋，作5 μm切片，Giemsa染色。采用骨组织形态计量学方法测量软骨下骨骨小梁。股骨远端测量骨密度，股骨髁置于4%多聚甲醛中固定，15%EDTA-2Na溶液脱钙，石蜡包埋，作4 μm连续切片。行HE染色、BMP-2和MMP-13免疫组化染色。

　　1.3 免疫组织化学(SABC法)

　　4 μm连续切片，平铺于涂有多聚赖氨酸的载玻片上，烤片4 h，脱蜡至水。3%过氧化氢冲洗10 min，PBS冲洗3次×5 min，复合酶37℃修复10 min。滴加抗兔BMP-2和MMP-13多克隆一抗抗体(购自武汉博士德)，37℃湿盒孵育2h。滴加生物素化二抗(购自武汉博士德)，高敏过氧化物酶复合物，DAB显色，苏木素复染，脱水透明，中性树胶封片。

　　1.4 观察指标

　　HE染色观察采用Mankin法评分，免疫组化切片观察染色情况，骨密度测量并记录三组标本股骨远端1/3骨密度和内(r1)外(r2)侧髁软骨下骨(软骨下0.2～0.6 cm间)的骨密度。Giemsa染色切片用Leica DMLB2荧光/光学显微镜及Leica DC300数码摄像系统进行观察与摄取图像;在20倍物镜下取软骨下骨板至骨骺上骨板间骨小梁为观察范围，每个切片随机选3个视野，测定骨组织形态计量学相关指标参数。

　　1.5 统计学分析

　　实验数据建立Excel数据库，采用SPSS 12.5统计软件进行单因素方差分析，两组间采用独立性“t”检验，以x-±s表示，以P<0.05表示差异有显著性。

　　2 结果

　　2.1 肉眼大体观察结果

　　由于膝关节前交叉韧带被切断，关节结构不稳定造成关节炎病理改变，软骨关节面破溃，并形成骨赘，以代偿关节的不稳定。Sham组膝关节面光滑完整，有光泽;ACLT+NS组膝关节面完整性遭到破坏，呈现颗粒感，表面晦涩、无光泽，滑液混浊;ACLT+XLGB组膝关节面较光滑完整，有光泽(图1)。

　　2.2 HE染色细胞形态学观察结果

　　HE染色显示：Sham组正常软骨基质染成粉红色，着色均匀，软骨细胞核呈深蓝色，胞浆呈粉红色，软骨细胞分3层，表层软骨细胞呈梭形，近似水平排列，中间层软骨细胞呈散在无序排列。柱状层软骨细胞呈柱状排列，其下方为潮线。钙化软骨层的细胞较大，其下方是骨质及骨髓腔;ACLT+NS组关节软骨表层可见单一软骨陷窝内有两个细胞核聚集，于软骨表层及中间层交界处，偶见大的、形态不规则的细胞，软骨细胞克隆增殖而呈巢状，细胞排列紊乱，软骨内细胞密度不均一，部分区域细胞密度增加或减少;ACLT+XLGB组软骨基质着色较均匀，软骨细胞分层清晰有序，细胞形态较规则。ACLT+NS组Mankin评分结果明显高于Sham组,表明本实验OA动物模型建立成功;ACLT+XLGB组较ACLT+NS组，Mankin评分结果明显降低,有统计学意义(P< 0.05)(见表1)。表1 各组Mankin评分结果

　　2.3 免疫组化BMP-2、MMP-13染色切片结果

　　MMP-13免疫组化染色，关节软骨细胞阳性表达的胞浆和胞外基质被染成棕黄色。Sham组胞浆和基质着色区域少，着色浅;ACLT+NS组胞质和胞外基质着色区域广泛，着色深，箭头所示为阳性细胞表达;ACLT+XLGB组胞浆和胞外基质着色范围较少，局限于软骨表层，阳性细胞较少且着色较浅，箭头所示为阳性细胞表达(图2)。

　　BMP-2免疫组化染色，关节软骨细胞阳性表达的胞浆和胞外基质染成棕黄色。Sham组，阳性细胞胞浆和基质着色区域较少，着色浅，箭头所示为阳性细胞表达;ACLT+NS组，胞质和胞外基质着色范围较少，局限于软骨表层且着色较浅;ACLT+XLGB组，胞浆和胞外基质着色区域广泛，着色深，箭头所示为阳性细胞表达(图3)。

　　2.4 骨密度测量结果

　　ACLT+XLGB组较ACLT+NS组，股骨远端dBMD(股骨远端1/3骨密度)骨密度升高，差别显著(P<0.05);股骨远端内、外侧髁软骨面下0.2～0.6 cm间软骨下骨骨密度r1BMD、r2BMD增高，但差别无显著性(见表2)。

　　2.5 骨组织形态计量学测量结果

　　ACLT+XLGB组与ACLT+NS组相比，骨小梁相对体积(BV/TV)、体积(Tb.Th)、数量(Tb.N)显著提高，而骨小梁分离度(Tb.Sp)显著下降(P<0.05)(见表3及图4)。　表2 各组骨密度测量结果表3 各组骨组织形态计量学测量结果

　　3 讨论

　　骨性关节炎(OA)病因复杂多样，目前其病机制还没有完全阐明。不过，从病理形态的改变观察可知：当修复不能代偿损伤时，膝关节软骨面破溃，软骨下骨、滑膜等关节重要结构受到累及，关节边缘逐步形成骨赘，最终导致关节炎加重，临床上表现为活动受限，导致生活质量的下降。

　　首先，本实验中所采用的3月龄大白兔OA模型，能够成功的复制骨性关节炎[6～9]，ACLT+NS组兔膝关节呈典型的关节炎表现，Mankin评分结果明显高于Sham组,表明造模成功。传统中药仙灵骨葆当前被广泛应用于骨质疏松症，在临床应用和实验研究中都得到了明显的效果。骨密度的检测结果表明仙灵骨葆增加骨关节炎大白兔胫骨骨密度，其原因与仙灵骨葆对成骨细胞和破骨细胞的作用有关。仙灵骨葆主要成分为淫羊藿、补骨脂、续断、地黄等，其中淫羊藿黄酮具有显著的促进成骨细胞增殖及增加矿化结节形成数量的作用。成骨细胞增殖分化，促进类骨质的矿化，增加骨小梁数目与体积，可以代偿骨组织的破坏，适应膝关节机械力学和生物学的变化。仙灵骨葆不仅促进成骨细胞增殖分化，它还可以明显抑制破骨细胞的分化及骨吸收功能[10]。

　　近年来的研究表明[11]，有多种细胞因子参与骨关节炎病程的进展，其中对基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinas，MMPs)和骨组织形态发生蛋白(bone morphogenic protein，BMP)的研究最为重要深入。MMPs由软骨细胞分泌，其信号通路受多种细胞因子调控[12]。在OA中，基质金属蛋白酶与其拮抗物(tissue inhibitor of matrix metal-loproteinas，TIMPs)之间的平衡被打破，MMPs表达升高，软骨细胞周围的基质被MMPs大量分解破坏，软骨结构不完整、破溃，并且随着严重程度的增加，MMPs表达将进一步升高。在基质金属蛋白酶家族中，MMP-13是一种胶原酶，它可以直接降解基质中占重要作用的Ⅱ型胶原。王玉彬等[13] 通过研究发现，MMP-13在正常软骨全层均呈低表达，但在退变软骨中的表达则明显增多，并且MMP-13在OA软骨全层表达均多于正常软骨。另外有证据表明[14]，在兔OA模型病程中晚期(造模12周后)MMP-13的表达是下降的，并且调控发生在蛋白质翻译前水平。而本实验采用造模后6周处死动物，其免疫组化结果表明，盐水组MMP-13表达较仙灵骨葆组增强，提示仙灵骨葆显著抑制了MMP-13表达，减轻对基质的主要成分—Ⅱ型胶原的降解，对关节软骨具有保护作用。BMP是转化生长因子(transforming growth factor-2β，TGF-2β)超家族中的一员，BMP-2是其中活性较高的诱导成骨的因子。BMP-2在骨组织发育成熟过程中一直都发挥至关重要的生理作用，在正常的软骨组织中，BMP-2也有一定的表达。BMP-2参与OA软骨和软骨下骨的重塑[15]。殷晓雪等[16] 利用人骨髓基质干细胞定向诱导分化为成骨细胞，发现浓度为20μg/mL的淫羊藿苷能够显著促进人成骨细胞BMP-2 mRNA的表达。本实验BMP-2免疫组化结果表明：仙灵骨葆可促进人成骨细胞的增殖和分化，进一步证实仙灵骨葆对骨关节炎有一定治疗作用。

　　伴随对骨性关节炎认识的逐步深入，日渐增多的证据显示，软骨下骨在骨性关节炎疾病进程中扮演的重要作用。关节软骨和软骨下骨是不断变形的，软骨下骨和钙化软骨的反复微损伤将启动骨重塑过程，随后形成的小梁骨痂增加了软骨下骨的密度和硬度。骨组织形态计量学是研究软骨下骨生物力学结构的重要方法，定量分析软骨下骨小梁数量、体积、厚度等这些具有代表性的指标。本实验的研究结果显示，仙灵骨葆组在骨小梁体积百分率、小梁厚度高于盐水组而分离度方面低于盐水组。表明仙灵骨葆125mg/(kg·d)灌胃，可以改善OA中骨小梁空间结构，维持软骨下骨力学特性与衬垫作用，有利于骨关节炎的防治。

　　从本实验结果中，作者可以得出：125 mg/(kg·d)仙灵骨葆灌胃膝骨关节炎新西兰大白兔，升高股骨远端骨密度(dBMD)，改善胫骨近端软骨下骨骨小梁结构，增加BMP-2的表达，抑制MMP-13表达，从而达到保护关节的作用。仙灵骨葆可能成为一种治疗OA的潜在药物选择。

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